超期储存小麦与水稻混合发酵生产燃料乙醇的研究
2021-09-03周娜娜李永恒孙振江何太波王小艳王泽兴张俊奇陈凡荣
周娜娜,李永恒,孙振江,何太波,王小艳,佟 毅,王泽兴,张俊奇,陈凡荣,李 凡,*
(1.中粮营养健康研究院有限公司,北京 102209;2.广西中粮生物质能源有限公司,广西 北海 536100;3.中粮生化能源(肇东)有限公司,黑龙江 肇东 151100;4.中粮生物科技股份有限公司,安徽 蚌埠 233010;5.玉米深加工国家工程研究中心,吉林 长春 130033)
燃料乙醇作为一种清洁的可再生能源,具有资源丰富、碳沉积少、减少温室气体排放等优点[1-3]。21世纪期初期我国开始发展燃料乙醇[4],随着车用燃料乙醇方案的推广,燃料乙醇行业发展迅速,成为可再生能源的重要组成部分[5-8]。
燃料乙醇发酵主要原料包括谷物原料、薯类原料、糖质原料以及纤维素原料,其中淀粉质原料主要为玉米、小麦、水稻和木薯等[9-10]。随着燃料乙醇行业的迅速发展,原料逐渐由单一原料向混合原料转化[11-12]。近年来,随着粮食产量的增加,我国水稻和小麦库存量巨大,大量超期储存粮亟待处理[13]。超期储存小麦和水稻是长期(3年以上)储藏的粮食,由于霉变、真菌毒素和重金属超标等问题,一般用于燃料乙醇的生产[14-15]。小麦和水稻原料的利用,能够实现原料多元化的柔性生产,避免企业过度依赖玉米原料,有效缓解原料供应紧张的问题[16],形成多种原料替代格局,增强企业活力和市场竞争能力,促进企业的长足、健康发展[17]。由于超标的小麦和水稻价格较低,通过优化处理等方式,能够降低企业生产成本,取得较好的经济效益,还能保证粮食安全[18]。
目前,燃料乙醇的研究热点主要聚焦在如何利用超期储存小麦、水稻等多种原料发酵生产燃料乙醇。刘劲松等[19]研究了脱壳水稻粉与玉米粉混合发酵,并对于发酵醪进行高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分析,筛选出超期储存水稻添加比例40%时,淀粉出酒率最高。沈存忠等[20]研究了超期储存水稻脱壳率对于燃料乙醇生产的影响,发现将稻谷进行一定程度脱壳生产,有利于生产稳定进行且降低生产成本。孙振江等[21]对于以小麦为原料进行酒精发酵研究,优化了适用于小麦发酵的固形物含量、液化时间和酶加量。其他相关的研究还有很多,这些研究也为燃料乙醇生产提供了指导。基于以上的情况,结合酒精工厂现有生产工艺情况,该研究以耐高温酒用干酵母为发酵菌株,采用同步糖化发酵法,通过测定液化醪和发酵醪指标,优化了超期储存小麦和水稻混合发酵的辅料,为复合原料生产燃料乙醇提供参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
超强复配淀粉酶(13万U/g)、低pH淀粉酶(14万U/g):诺维信(中国)生物技术有限公司;耐高温淀粉酶(18万U/g)、糖化酶(26万U/g)、酸性蛋白酶(10万U/g):山东隆科特酶制剂有限公司;α-淀粉酶(14万U/g):杰能科(中国)生物工程有限公司;蔚蓝木聚糖酶(3万U/g)、夏盛木聚糖酶(3万U/g)、挑战定制酶(5万U/g)分别为青岛蔚蓝生物股份有限公司、夏盛(北京)生物技术有限公司、北京挑战生物技术有限公司惠赠;耐高温酒用干酵母:安琪酵母股份有限公司;安菌泰杀菌剂:柳州龙泰科技有限公司;色谱标品均为色谱纯,其他试剂均为分析纯;超期储存水稻和小麦取自广西中粮生物质能源企业车间。
1.2 仪器与设备
ZHWY-2112F摇床:上海智城分析仪器制造公司;安捷伦1200型液相色谱:安捷伦科技公司;3-18K离心机:美国Sigma公司;KQ-800KDV超声清洗机:江苏省昆山超声仪器公司;WELCH 2546C-02真空泵:美国威尔奇公司;AL204分析天平:瑞士Mettler公司;DSH-50-10快速水分测定仪:上海越平科学仪器有限公司;NDJ-5S黏度计:上海精密仪器有限公司;液化罐、蒸馏冷凝装置:河南神泰公司定制;HWS-28水浴锅:上海一恒科学仪器有限公司;PHSJ-3F pH计:上海雷磁仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 燃料乙醇生产工艺流程及操作要点
操作要点:
小麦和水稻粉碎后均过20目筛网,按一定比例混合,加入保温70 ℃的混合水(清液∶工艺水∶中水比例为34∶51∶15),控制粉浆干物质含量30%左右,调节pH5.6,添加α-淀粉酶0.17 kg/t粮,进行拌料30 min。然后将温度升至90 ℃,液化120 min,整个液糖化和发酵流程具体参考文献[21]。
将液化醪降温至32 ℃,硫酸调节pH至4.2~4.4,装液量200 mL/500 mL,发利耐高温酒用干酵母接种量0.05%,糖化酶加量0.68 kg/t粮,酸性蛋白酶加量0.035 kg/t粮,安菌泰5 mg/L,转速100 r/min,发酵时间72 h。
发酵完成后,取100 mL成熟醪,加入100 mL去离子水,混合均匀后用蒸馏冷凝装置蒸酒;蒸酒后剩余的残液直接用板框布过滤,计算5 min内的过滤速率;滤液用快速水分测定仪测定干物含量。
1.3.2 检测方法
(1)理化指标的测定
粗脂肪按国标GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[22]测定;粗蛋白按国标GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》方法测定[23];半纤维素和纤维素参考文献测定[24];灰分按国标GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》[25]测定;淀粉按国标GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的测定》[26]方法测定;还原糖的检测:按国标GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》[27]测定;干物质的检测:使用快速水分测定仪测定;黏度:使用黏度测定仪测定;酒精度:酒精计法。
(2)DE值和淀粉出酒率的计算
葡萄糖当量(dextrose equivalent)值及淀粉出酒率的计算公式如下:
(3)发酵醪组成的测定
采用高效液相色谱法进行测定,色谱柱:HPX-87H(300 mm×7.8 mm);流动相:0.005 mol/L H2SO4;泵流速:0.6 mL/min;柱温:65 ℃;示差折光检测器,设置温度:50 ℃;进样量20 μL;运行时间30 min。
1.3.3 试验优化
小麦添加比例优化实验:拌料阶段将小麦分别按0%、30%、50%和100%添加至水稻中,其余步骤与1.3.1一致,测定各组指标。
不同种类淀粉酶的筛选实验:将小麦按30%比例与水稻混合,以淀粉酶活性一致进行添加,设置4组实验,拌料阶段分别添加超强复配淀粉酶(0.26 kg/t粮)、隆大耐高温淀粉酶(0.21 kg/t粮)、低pH淀粉酶(0.26 kg/t粮)和杰能科α-淀粉酶(0.17 kg/t粮,对照),其余步骤与1.3.1一致,测定各组指标。
降黏酶种类及添加方式的筛选实验:将小麦按30%比例与水稻混合,根据降黏酶的耐温特性,设置4组实验,分别在拌料阶段额外添加蔚蓝木聚糖酶、夏盛木聚糖酶,同步糖化发酵阶段额外添加夏盛木聚糖酶、挑战定制酶,各组酶添加量均为0.3 kg/t粮,其余步骤与1.3.1一致,对照组为不添加降黏酶的实验,测定各组指标。
1.3.4 数据处理
实验数据均以均值表示,采用Excel 2010作图。
2 结果与分析
2.1 原料成分分析
将超期储存的小麦和水稻进行全组分分析,结果如表1所示,从粗脂肪和灰分含量来看,小麦中的两种成分含量均低于水稻,更利于发酵时的原料利用。从淀粉含量来看,小麦中的淀粉含量要比水稻中的高出约6个百分点,添加小麦更有利于发酵酒精度的提高。此外,小麦的粗蛋白和半纤维素含量分别是水稻的1.8和1.7倍,在液化发酵时会导致醪液的黏度较大,泡沫多,装料系数小[28]。因此,需要摸索小麦的最佳添加比例,在提高混合原料的淀粉含量的同时,醪液黏度也在可接受范围内,减少设备的处理压力。
表1 超期储存小麦和水稻原料的全组分分析Table1 Total component analysis of aging wheat and rice raw materials%
2.2 小麦添加比例优化实验
小麦中的蛋白和可溶性戊聚糖是小麦醪液黏度高的主要原因[28],当小麦与水稻掺混使用时,醪液浓度也会因高黏度受到限制,因此需要摸索小麦的添加比例。本实验设计了不同的小麦添加比例对液化醪进行黏度、还原糖和干物等指标的影响,结果见表2。
由表2可知,在同一拌料干物下,随着小麦添加比例的升高,液化醪的黏度明显升高,液化干物也随之提高。这可能是小麦中麸皮的存在,导致混合原料整体吸水性增强[29],使得干物含量升高,从而导致液化后醪液的黏度有大幅升高。醪液黏度升高在生产上会导致管道的堵塞和压力升高,不利于生产设备的连续运行[30]。基于工厂设备管道对于醪液黏度的承受范围,陈化小麦添加30%是可以接受的。对不同小麦添加比例的成熟醪进行高效液相色谱HPLC分析,结果见表3。
表3 不同小麦添加比例对成熟醪指标的影响Table3 Effect of different wheat addition ratios on indexes of mature mash
由表3可知,随着小麦添加比例的升高,残糖(DP4+、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖)、副产物(如甘油和乙酸)等有所升高,成熟醪黏度在小麦添加比例在50%及以上时黏度升高较明显。
乙醇/甘油是反映发酵质量的重要指标[31],其值越高说明发酵水平越高,需控制在一定范围内。当小麦添加比例高于30%时,此值明显下降。这说明小麦添加比例超过一定范围时,会导致酵母发酵生产酒精的性能下降,产生更多的副产物—甘油等。淀粉出酒率是乙醇质量(以95%vol计)与原料中淀粉含量的比值[31],由于两种原料按不同比例混合时的淀粉含量差异较大,以淀粉出酒率表征发酵效率较为准确。结果显示,当小麦添加比例0和30%时,淀粉出酒率最高,均为53%。
结合液化醪及成熟醪分析结果,综合考虑,30%小麦的添加比例比较合理,对于生产稳定性影响较小,且提高了乙醇产量。
2.3 不同种类淀粉酶的筛选实验
耐高温淀粉酶可以快速将长链淀粉切割成长短不一的糊精,因此具有明显的降黏效果[32]。不同厂家的耐高温淀粉酶来源有所差异,对于同一种底物的降解效果也会不同。针对优化出的30%小麦添加比例的混合原料,主要考察淀粉酶对于液化醪黏度及发酵效果的影响,结果见图1。
由图1可知,从液化醪黏度来看,超强复配淀粉酶对于液化醪的降黏效果最佳,液化醪黏度为372 mPa·s,其次是杰能科α-淀粉酶。从发酵酒精度来看,使用超强复配淀粉酶的酒精度最高为12.37%vol,其余三种淀粉酶酿造的酒精度约为11.38%vol,约高出1个百分点。这可能与超强复配淀粉酶中复配了耐高温的蛋白酶有关。由于小麦原料中蛋白含量较高(表1),影响着液化醪液的黏度,而超强复配淀粉酶中的蛋白酶可以较好的发挥作用,缓解了小麦添加带来的黏度升高。由于小麦蛋白的降解,可能使得混合原料的淀粉释放更彻底,从而导致酒精度的升高。因此,针对添加30%陈化小麦的混合原料,使用超强复配淀粉酶更适合。
图1 不同种类淀粉酶对液化和发酵的影响Fig.1 Effect of different amylases on liquefaction and fermentation
2.4 降黏酶种类及添加方式的筛选实验
小麦麸皮中含有较高的非淀粉多糖,在水溶液中形成黏度较高的胶体溶液,导致添加小麦后醪液黏度升高,最终导致清液干物的升高,增大了后期污水处理的压力。降黏酶含一系列能够对非淀粉多糖(纤维素、半纤维素、木聚糖和β-葡聚糖)进行转化和分解的酶[33]。采用降黏酶来水解非淀粉多糖[34],可以降低小麦预处理过程中的黏度[26],从而提高初始拌料干物和后续发酵酒精度。根据不同酶的酶学特性,设计不同降黏酶种类及添加方式的降黏效果对比见图2。
图2 不同降黏酶种类及添加方式的降黏效果Fig.2 Viscosity lowering effect of different types and adding ways of viscosity lowering enzyme
首先,从降黏酶的添加方式来看,在拌料阶段添加降黏酶可以显著将液化醪黏度从449 mPa·s降低至140 mPa·s左右,并且发酵醪黏度也出现明显下降;相比之下,在发酵阶段添加降黏酶只能降低发酵醪黏度,并不能解决前期液化醪黏度高的问题。对于蒸酒后的残液进行滤速和滤后干物分析,发现不管何种降黏酶和添加方式,均能不同程度的提高残液的滤速(以5 min内的过滤速率计),在拌料阶段添加蔚蓝木聚糖酶的滤速最高,由对照(不添加降黏酶)的4.8 mL/min提高至7.8 mL/min;最终滤过的清液干物也由对照的8.2%降低至5.7%。这可能是由于小麦麸皮中半纤维素含量较高(表1),降黏酶尤其是木聚糖酶的添加促进了小麦麸皮的部分降解,使得大分子的非淀粉多糖降解成长短不一的小分子,从而导致表观黏度下降,蒸馏残液过滤速度快。因此,结合黏度、滤速及清液干物结果分析,降黏酶在拌料阶段添加效果最佳,最优的降黏酶是蔚蓝木聚糖酶,参考工厂中降黏酶的添加量,选择添加量为0.3 kg/t粮。
3 结论
该文通过摇瓶发酵小试实验,优化了超期储存小麦和水稻混合发酵生产燃料乙醇的发酵辅料。在两者混合发酵生产乙醇时,干物质含量为30%,小麦添加比例30%,使用超强复配淀粉酶的条件下,液化醪黏度最低(约370 mPa·s),酒精度最高可达12.37%vol。若在拌料阶段额外添加0.3 kg/t粮的蔚蓝木聚糖酶,可显著降低液化醪和发酵醪黏度,蒸馏残液滤速(以5 min内过滤速率计)由4.8 mL/min提高至7.8 mL/min,清液干物由8.2%降低至5.7%,从而有效的减轻后期污水处理压力。这为更多元谷物的生产优化提供一定的指导思路。