miR-126基因启动子甲基化状态与高危低级别胶质瘤同步放化疗后生存结局的关系

平建峰 麻来峰 林昌福

低级别胶质瘤（low-grade glioma，LGG）具有显著的个体差异性，生存时间可长达10 年以上[1]。目前，其最佳治疗方案仍有争议。近年来，染色体1p/19q 联合缺失以及异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）基因突变等与LGG 更好的预后和放化疗反应有关[2]。越来越多的研究显示微小核糖核酸（microRNA，miRNA）有望成为肿瘤病人临床靶向治疗和个体化治疗的潜在生物标志物。miR-126 是位于表皮生长因子样结构域7 宿主基因第9q34.3 号染色体上的重要miRNA，与脑胶质瘤的放化疗敏感性有关[3]。本文探讨miR-126 基因启动子甲基化状态与高危LGG 病人同步放化疗后生存结局的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入标准：①符合WHO 神经系统肿瘤分级标准Ⅱ级，病理检查证实为星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤或混合胶质细胞瘤，未行肿瘤全切术，且存在以下3种或以上高危因素（年龄≥40岁；术前肿瘤直径≥6 cm；肿瘤越过中线；星形胶质细胞瘤/混合型组织学特征；术前神经功能状态＞1级，即中、重度）；②术前未接受放、化疗；③术前Zubrod-ECOG-WHO 评分0～2 分。排除标准：①合并严重心、肺、肝、肾等重要脏器功能障碍或其他部位原发恶性肿瘤；②伴有严重高血压病史、出血倾向、抗凝治疗；③既往接受过头颈部放疗或化疗。

前瞻性收集2015年7月至2016年9月术后病理证实为高危LGG 共69 例。选取同期因颅脑损伤内减压术切除的非肿瘤脑组织样本20 例为对照。本研究经本院伦理审查委员会批准。

1.2 治疗方法 术后均接受同步放化疗。使用西门子加速器精确调强技术或三维适形技术进行放疗，根据头颅CT/MRI 确定勾画靶区，放疗剂量为2 Gy/次，2次/d，5d/周，共持续6周，总剂量为60 Gy。放疗前开始口服替莫唑胺，采用stupp方案。若不良反应较严重，且对症治疗无效，则减量[替莫唑胺剂量最低不得＜100 mg/（m2·d）]或停药处理。

1.3 检测方法

1.3.1 采用RT-qPCR 法检测miR-126 表达 使用TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司）提取组织总RNA，采用逆转录系统（美国Promega 公司）合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增（美国Applied Biosystems公司），扩增条件：95 ℃1 min，62 ℃1 min，72 ℃1.5 min；共35 个循环。以U6 mRNA 为内源性参考基因。采用2-ΔΔCT法进行量化分析。每个样本进行3次PCR检测。

1.3.2 miR-126 启动子区甲基化状态分析 使用DNeasy 血液和组织试剂盒提取基因组DNA。根据EpiTect Bisulfite Kit（德国Qiagen 公司）说明书对DNA样本进行亚硫酸氢盐转化，并用Wizard DNA纯化树脂（美国Promega公司）对修饰后的DNA进行纯化。以CpGenome Universal Methylated DNA（美国MilliporeSigma公司）作为阳性对照，使用亚硫酸氢盐转化的DNA 为模板，采用Pyromark PCR 试剂盒（德国Qiagen 公司）进行PCR 扩增（95 ℃初始变性10 min，共35个循环：94 ℃15 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，最终延伸在72 ℃10 min）。PCR产物经用2%琼脂糖凝胶电泳分离，采用PyromarkTMQ24 焦磷酸测序仪进行焦磷酸测序，测序结果采用PyromarkTMQ24v2.0.6软件（德国Qiagen公司）进行分析。

1.4 近期疗效 根据实体肿瘤疗效评价标准[4]：完全缓解（complete remission，CR）、部分缓解（partial remission，PR）、疾病稳定（stable disease，SD）和疾病进展期（progressive disease，PD）。CR+PR 为放化疗敏感组，SD+PD为不敏感组。

1.5 随访 随访截止时间为2021年5月31日，69例胶质瘤随访19～55 个月，中位时间27 个月。主要终点为无进展生存期（progression-free survival，PFS）、总生存期（overall survival，OS）。PFS 定义为手术至观察到疾病进展的时间，OS定义为手术至发生任何原因死亡的时间或随访截止时间。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件分析；计数资料采用χ2检验；计量资料以x±s表示，采用t检验；采用Spearman 相关系数分析相关性；采用多因素logistic回归分析放化疗敏感性的影响因素；采用多因素Cox比例回归风险模型分析生存结局的影响因素；绘制Kaplan-Meier 生存曲线分析生存时间，采用log 检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高危LGG组织miR-126表达水平和甲基化状态LGG 组织miR-126 表达水平显著低于非肿瘤脑组织（P＜0.001），同时miR-126 基因启动子甲基化率（49.28%，34/69）明显高于非肿瘤脑组织组（20.00%，4/20；P＜0.05）。见图1。

图1 高危低级别胶质瘤组织miR-126水平及其基因启动子甲基化水平检测

2.2 高危LGG组织miR-126表达和基因启动子甲基化状态的关系miR-126 基因启动子甲基化组miR-126 表达水平（0.496±0.174）明显低于非甲基化组（0.868±0.187；P＜0.001）。高危LGG组织miR-126表达水平和其基因启动子甲基化水平呈明显负相关（r=-0.722；P＜0.001）。

2.3 高危LGG组织miR-126表达水平和基因启动子甲基化状态与同步放化疗敏感性的关系69例中，放化疗敏感33例，不敏感36例。敏感组高危LGG组织miR-126表达水平（0.912±0.131）明显高于不敏感组（0.476±0.147；P＜0.05）。敏感组高危LGG组织miR-126启动子甲基化率（18.18%，6/33）明显低于不敏感组（77.78%，28/36；P＜0.05）。多因素logistic 回归分析显示胶质瘤组织miR-126基因启动子高甲基化率是高危LGG 同步放化疗不敏感的独立危险因素（OR=1.078；95%CI 1.023～1.268；P＜0.001）。

2.4 高危LGG病人生存结局的影响因素 多因素Cox回归分析显示，胶质瘤组织miR-126 基因启动子高甲基化是高危LGG同步放化疗生存结局不良的独立危 险 因 素（HR=1.212；95% CI 1.093～1.645；P=0.001）。

2.5 胶质瘤组织miR-126甲基化状态与高危LGG病人同步放化疗后生存时间的相关性 根据miR-126基因启动子甲基化状态，甲基化组和非甲基化组。Kaplan-Meier 生存曲线显示，胶质瘤组织miR-126基因启动子甲基化组OS、PFS 较非甲基化组明显延长（P＜0.001；图2）。

图2 Kaplan-Meier生存曲线分析miR-126基因启动子甲基化状态与高危LGG同步放化疗生存结局的关系

3 讨论

目前，LGG多采取手术治疗，但大部分病人仍会复发或进展，尤其是高危LGG；因此绝大多数高危LGG更倾向于术后进行同步放化疗。我们发现高危LGG 组织miR-126 呈低表达，且与近期放化疗疗效和远期生存结局有关，因此，miR-126可能在预测高危LGG病人预后中有一定价值。

在脑胶质瘤微环境中，肿瘤细胞与周围成分间的通信可能直接影响脑胶质瘤的特征，如肿瘤细胞可以通过微环境改变非肿瘤性星形胶质细胞的表型，进而促进脑胶质瘤的生长和侵袭[5]，而细胞间转移的miRNA 可通过调节邻近细胞甚至遥远细胞的表型在细胞-细胞通信中发挥重要作用。目前，已有多种miRNA 被证实参与脑胶质瘤的病理机制[6，7]。miR-126 被证实具有一定的抑癌基因活性，其下游靶基因，如整联蛋白α-6、高尔基体磷蛋白3、成熟T细胞增殖蛋白1、GATA74 等在脑胶质瘤细胞生长、迁移、上皮间质转化、细胞骨架形成等过程中具有重要作用[8～11]。有学者认为高危LGG 预后与IDH1/2 突变相关，IDH突变会导致STAT1蛋白降低，通过调节T 细胞吸引趋化因子、影响CD8+T 细胞的累积影响LGG免疫环境[12]。

DNA 甲基化、组蛋白修饰在内的表观遗传机制的基因表达调控，在肿瘤的发生发展中起关键作用，异常的表观遗传调控可以导致基因表达改变和细胞恶性转化。Cui等[13]研究发现，40%的脑胶质瘤miR-126启动子存在高甲基化状态。本文证实脑胶质瘤组织miR-126基因启动子甲基化率明显高于正常脑组织组，且胶质瘤组织miR-126 水平和其基因启动子甲基化呈明显负相关。这说明表观遗传修饰是影响miR-126在脑胶质瘤中表达的重要机制之一。此外，本文结果表明胶质瘤组织miR-126 基因启动子非甲基化病人比甲基化病人拥有更长的PFS及OS。

总之，DNA 甲基化是调节miR-126 表达的重要机制之一，两者呈负相关。胶质瘤组织miR-126 高甲基化率是导致高危LGG 病人同步放化疗不良结局的独立危险因素，因此检测胶质瘤组织miR-126基因启动子甲基化状态有助于临床对高危LGG 病人同步放化疗效果及预后的评估。