无溶剂微波萃取肉桂精油及成分分析

陈珏锡，张俊丰，李源栋，夏建军

（1.湘潭大学环境与资源学院，湖南湘潭 411105）（2.云南中烟工业有限责任公司，云南昆明 650032）

肉桂（Cinnamomum cassia Presl），又名牡桂和玉桂，属双子叶樟科乔木。原产自中国广东、福建、云南等热带及亚热带地区，境外如印度、老挝、越南至印度尼西亚等地也广为栽培[1]。中国对肉桂的药用价值的探究，可以追溯到秦朝之前，《神农本草经》中记载，肉桂主上气咳逆，结气喉痹吐吸，利关节，补中益气。肉桂富含丰富的挥发油，张笮晦等的研究表明肉桂中挥发油的含量达到 1.75%~6.41%[2]。肉桂精油为黄色或红棕色油状液体，其含有桂皮醛、醋酸桂皮酯、苯甲醛和桂皮酸等[3,4]天然成分，广泛应用于医疗、食品及香料领域。

目前肉桂精油的提取主要采用水蒸气蒸馏法（Steam distillation，SD）[5]，超临界 CO2萃取技术（Supercritical CO2extraction，SFE-CO2）[6]，超声波辅助水蒸气蒸馏法（Ultrasonic assisted hydrodistillation，UAHD）[7]。但这些方法面临着提取效率不高、操作复杂、有机溶剂残留及能耗大等问题，并且提取过程中可能会造成部分挥发性化合物的损失。本着“绿色化学”的理念，本研究采用无溶剂微波萃取工艺（Solvent-free Microwave Extraction，SFME），该方法利用微波辐射使植物细胞中的分子键位产生热效应，促使细胞膜和细胞壁破裂，让细胞组织内的精油充分释放出来[8]。与传统的水蒸气蒸馏法相比，无溶剂微波萃取工艺提取效率更高、不需要添加任何溶剂、并能获得更高品质的植物挥发油以及更加清洁和环保。

目前还未有关于无溶剂微波萃取工艺提取肉桂精油的相关报道，因此本研究对无溶剂微波萃取工艺条件进行优化；采用气相色谱-质谱（Gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）对精油进行成分鉴定；并利用扫描电子显微镜 SEM 观察萃取后的肉桂微观形貌；此外，将精油成分、抗氧化性能力和肉桂表面形貌特征与水蒸气蒸馏法相对比，以期为肉桂的开发及利用提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 原料

药材购于云南省官渡区菊花村中药材批发市场，产地云南，经鉴定为樟科植物肉桂的干燥树皮，粉碎过40目筛。

1.2 仪器与试剂

试剂：二氯甲烷、甲醇、正己烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、无水乙醇、邻二氮菲、硫酸亚铁、双氧水、磷酸二氢钠，GR级，百灵威科技有限公司；L-抗坏血酸（Vc）、正构烷烃 C7-C30，美国Sigma-Aidrich公司。

仪器：WLD07S-05型微波设备，南京三乐微波技术发展有限公司；超高速多功能粉碎机，SZ-500A-3永康市善竹贸易有限公司；Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪+自动进样器，美国安捷伦科技有限公司；万分之一电子天平，瑞士Mettler Tloede公司；10 mL移液器，德国Eppendorf公司；JSM-6610LV扫描电子显微镜，日本JEOL公司。

1.3 肉桂挥发油提取方法

1.3.1 无溶剂微波萃取工艺

将100.00 g桂皮原料（40 目），通过间歇式喷雾加水配置成一定含水量的样品，装入500 mL蒸馏烧瓶中，将样品浸润一定时间后放入微波萃取装置内，调节微波功率和提取时间。观察挥发油收集器中挥发油含量，将提取的精油于4 ℃下保藏，待测[9]。

1.3.2 水蒸气蒸馏法

将100.00 g桂皮原料（40目），装入500 mL蒸馏烧瓶中，按常规水蒸气蒸馏法进行连续萃取，直到挥发油收集器中挥发油含量不再增加为止（耗时6 h），测得挥发油测定器内的精油量，于4 ℃下保藏，待测。

1.4 GC/MS分析条件

色谱条件：RXi-5sil MS石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 µm），载气为氦气（纯度为99.99%），流速：1.00 mL/min。升温程序：初始温度60 ℃，保持6 min；以3 ℃/min的速率升温至180 ℃；再以10 ℃/min的速率升温至230 ℃，保持10 min。进样口温度：250 ℃，进样量：1.0 µL，分流比：10:1，溶剂延迟6 min。

质谱条件：电轰击电离（EI）源；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；电离能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；扫描范围：40m/z~450m/z，质谱检索图库：Nist11谱库。

1.5 扫描电子显微镜SEM

使用JSM-6610LV扫描电子显微镜表征不同提取方法的样品表观形貌变化。将无溶剂微波处理肉桂样品、水蒸气蒸馏处理肉桂样品和空白样品干燥后，用导电胶固定在台面上，然后将样品喷金 100 s；并在高真空和10.0 kV电压的条件下进行测试。

1.6 抗氧化活性的测定方法

1.6.1 DPPH自由基的清除

参考王园等的方法[10]，准确称取2.0 mL不同浓度样品溶液于试管中，加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2.0 mL，震荡均匀后，置于阴暗处20 min，在517 nm波长处测定吸光度，测到样品溶液和DPPH溶液的吸光度Asample；准确称取2.0 mL样品溶液于试管中，加入蒸馏水2.0 mL，震荡均匀后，于阴暗处放置20 min，在517 nm，测得空白样品吸光度Ablank；再准确取2.0 mL的DPPH溶液于试管中，加入蒸馏水2.0 mL，震荡均匀后，置于阴暗处20 min，在517 nm处测定吸光度，测得DPPH溶液吸光度ADPPH；各重复3次试验，后求平均值，DPPH自由基清除率计算公式如下：

1.6.2 羟基自由基的清除

参考纪俊敏等的方法[11]，向10 mL试管中准确加入7.5 mmoL/L的邻二氮菲溶液1.0 mL，2 mol/L的PH7.4磷酸盐缓冲溶液2 mL和样品溶液1.0 mL，充分震荡后，加入7.5 mmol/L硫酸亚铁溶液1.0 mL，再次混匀后加入1.0 mL 0.1% H2O2，置于38 ℃恒温水浴中60 min后，于波长536 nm处测吸光度，记作AS；以去离子水代替样品作为空白实验进行对比，测得的吸光度记作Ab；以去离子水替代H2O2作为损伤组，测得的吸光度记作An，OH自由基清除率计算公式如下：

OH自由基清除率/%=[(AS-An)/(Ab-An)]×100%

1.7 数据处理

采用Minitab 19软件进行正交试验设计及无溶剂微波工艺条件优化；肉桂油化学成分鉴定采用 Nist 11谱库进行检索后，结合ESO香精保留指数进行对比和定性，利用面积归一化计算各成分相对百分含量；采用SPSS 22和origin 8.0对试验数据结果进行数据处理和可视化分析。

2 结果与讨论

2.1 SFME各因素对精油得率的影响

2.1.1 提取时间对精油得率的影响

从图1可以看出，提取时间在30~50 min时，肉桂精油提取率有较大增幅，50~60 min肉桂精油提取率的增速减缓，60 min以后肉桂精油提取率基本不再增加。因为微波处理时间过短，肉桂的细胞壁及胞内热效应程度低，细胞不能完全破裂，精油不能充分溶出，随着提取时间的延长，植物细胞破碎程度增高，精油提取率也相应增加[12]。

图1 提取时间对精油得率的影响Fig.1 Effect of extraction time on the yield of essential oils

2.1.2 微波功率对精油得率的影响

由图2可知，在微波功率调至300 W~400 W时，肉桂精油提取率增长迅速，当微波功率达到 400 W~450 W，肉桂精油提取率呈现一个峰值，微波功率在450 W以后，肉桂精油呈下降趋势。因为微波功率会影响整个系统的升温速度和溶剂分子的震荡频率，当微波功率过小时，系统升温速度慢，植物细胞破碎程度低，而微波辐射功率过高时，会降解挥发出的化合物以及植物材料[13,14]。在微波功率500 W下萃取60 min，植物样品出现了碳化现象。

图2 微波功率对精油得率的影响Fig.2 Effect of microwave power on the yield of essential oils

2.1.3 含水率对精油得率的影响

从图3可以看出，随着含水率的增加，精油得率也呈先上升后下降趋势。含水率在 60%~70%之间使肉桂精油得率达到峰值。而含水率超过70%，肉桂精油得率逐渐降低。其原因主要是，含水率适当时，分子扩散有利于肉桂精油的提取[15]。过高的含水率使水分子对微波有强的吸附作用，降低达到细胞内部的辐射，从而使肉桂油得率下降。

图3 含水率对精油得率的影响Fig.3 Effect of moisture content on the yield of essential oils

2.1.4 浸润时间

由图4可知，肉桂精油得率随着浸泡时间的增加而上升。肉桂精油存在于细胞组织中，用水浸润过后能加速植物细胞壁和细胞膜的膨胀和分裂，从而提高针叶精油肉桂精油的提取率。当提取时间达到2 h时，肉桂精油提取率的增长速率放缓，在2.5 h以后趋于稳定。适当的含水率有利于肉桂精油的溶出，但是当浸润时间在2~3 h的时候，肉桂粉末对水的吸收已经达到了饱和，延长浸润时间无助于提高肉桂精油的提取率[16]。

图4 浸润时间对精油得率的影响Fig.4 The effect of soaking time on the yield of essential oils

2.2 正交试验优化无溶剂微波萃取工艺条件

在上述单因素试验结果中，以肉桂精油得率为评价指标。选择提取时间（50 min、60 min、70 min）、微波功率（400 W、450 W、500 W）、含水率（50%、60%、70%）、浸润时间（1.5 h、2 h、2.5 h）进行四因素三水平正交试验，从而优化无溶剂微波萃取工艺条件。正交试验因素设计表如表1所示，试验设计结果如表2所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Horizontal table of orthogonal test factors

表2 试验结果与分析Table 2 Orthogonal test design and results

从表2可以看出，4个重要因素指标对试验影响大小的排序为：提取时间>微波功率>含水率>浸润时间，无溶剂微波萃取工艺提取肉桂油的最佳试验条件为提取时间60 min、微波功率450 W、含水率60%、浸润时间2.5 h。在此条件下，进行5次平行试验后精油得率平均值为3.15%，优于工艺优化前的得率，较水蒸气蒸馏法提高了 35.78%，因此最优工艺条件为A2B2C2D3。无溶剂微波萃取工艺四因素三水平正交试验结果与显著性分析见表3，因为浸润时间对肉桂油得率影响最小，故将D浸润时间作为误差项，对其他因素进行显著性分析，得出提取时间A对肉桂油得率具有显著影响(p<0.05)。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test results

2.3 肉桂油GC/MS分析

肉桂油中化学成分经 GC/MS检测所得到总离子流色谱图如图5所示，其结果采用Nist11谱库进行检索后结合 ESO香精保留指数进行对比对其定性[17]，利用面积归一化计算得出桂皮油中各成分相对百分含量，结果见表4。

图5 肉桂油(SFME)气相色谱/质谱总离子流色谱图Fig.5 Gas chromatographic/mass spectrometry total ion chromatogram of cinnamon oil extracted by SFME method

表4 GC/MS方法对肉桂油挥发性成分的定性结果Table 4 Composition analysis of cinnamon oil

图6 肉桂油(SD)气相色谱/质谱总离子流色谱图Fig.6 Gas chromatography/mass spectrometry total ion chromatogram of cinnamon oil extracted by SD method

图7 无溶剂微波和水蒸气蒸馏肉桂油中主要化合物的百分比含量Fig.7 Percentage content of the main compounds of cinnamon essential oil extracted by SFME and HD

通过质谱库检索和人工图谱解析，并结合保留指数比对，在无溶剂微波萃取肉桂油中主要鉴定出 24种化合物，占挥发性成分91.63%，烯烃类10种，酯类3种，醇类4种，醛类4种，其它化合物3种，按含量数值从大到小依次为：(E)-肉桂醛（67.69%）、丁香酚（11.36%）、芳樟醇（4.26%）、柠檬烯（2.40%）等化合物；水蒸气蒸馏萃取肉桂油中主要鉴定出 25种化合物，占挥发性成分88.94%，烯烃类11种，酯类4种，醇类3种，醛类4种，其它化合物4种，按含量数值从大到小依次为：(E)-肉桂醛（59.12%）、丁香酚（14.13%）、芳樟醇（5.39%）、柠檬烯（1.78%）等化合物。无溶剂微波萃取工艺不需要溶剂，产生的水解效应更低，因此能得到高比例的含氧化合物[18]。

无溶剂微波萃取与水蒸气蒸馏萃取肉桂油的共有成分 20种，主要为萜烯类。而无溶剂微波萃取肉桂油中增添了(Z)-氧化芳樟醇5(呋喃型)、苯丙醛、香叶醇、δ-杜松烯，未检测出α-水芹烯、乙酸苄酯、胡椒酚、α-甲基(E)-肉桂醛、α-蛇麻烯。相较于水蒸气蒸馏萃取肉桂油，无溶剂微波萃取肉桂油中抗肿瘤活性成分(E)-肉桂醛含量提升了14.49%，肉桂醛是肉桂油的主要成分，肉桂醛的含量直接影响肉桂油的品质，肉桂醛广泛应用于医疗、食品和保健领域[19,20]，具有杀菌防腐、促进血液循环和抗肿瘤的效果[21,22]。此外，无溶剂微波萃取肉桂油中柠檬烯的含量较水蒸气蒸馏萃取肉桂油提高了34.51%，柠檬烯能有效抑制致腐微生物的生长，而且对人体无毒害作用，具有良好的药用潜在价值[23,24]。

2.4 SEM形貌特征

为了进一步阐明无溶剂微波萃取肉桂油的机理，采用扫描电子显微镜SEM观察未经处理的肉桂样本、水蒸气蒸馏后的肉桂样本和无溶剂微波萃取后的肉桂样本。如图8a所示，未经任何处理的样品的外部结构光滑且较为完整，没有观察到明显的破坏。经水蒸气蒸馏提取后（图8b），样品表面出现了一定程度的破裂。而经无溶剂微波萃取后（图8c和图8d），样品表面可以观察到明显的空隙，并且具有许多不规则的空腔结构。水蒸气蒸馏工艺的传热主要是通过传导和对流实现的；相比之下，无溶剂微波萃取过程中，细胞内部的热量积累超过了其传输能力，而导致细胞破裂得更快及更彻底[25]。显然，与水蒸气蒸馏提取工艺相比，无溶剂微波萃取工艺能获得更高的精油得率。

图8 肉桂表面的SEM形貌特征Fig.8 SEM images of cinnamon

2.5 抗氧化活性测定

2.5.1 DPPH自由基清除率

对DPPH的清除率，如图9所示。随着质量浓度的不断增加，无溶剂微波萃取肉桂油和水蒸气蒸馏肉桂油和对DPPH自由基的清除率皆呈先增高后趋于稳定的趋势；当质量浓度提升至5 mg/mL时，两种方法提取的肉桂油对DPPH自由基的清除率皆达到80%以上，且无溶剂微波萃取肉桂油的DPPH·清除率优于水蒸气蒸馏肉桂油；对两者的IC50进行计算，分别为2.10 mg/mL（无溶剂微波萃取肉桂油）、2.37 mg/mL（水蒸气蒸馏萃取肉桂油）。

图9 不同方法萃取肉桂油对DPPH自由基的清除作用Fig.9 Scavenging activity of cinnamon oil extracted by different methods on DPPH free radical

2.5.2 羟基自由基清除率

由图10可知，无溶剂微波萃取肉桂油和水蒸气蒸馏肉桂油在0.1~0.8 mg/mL范围内，对羟基自由基的清除率随精油浓度的升高而趋于平缓，在 0.8 mg/mL的浓度时，两者的清除率分别为 90.57%和86.27%；无溶剂微波萃取肉桂油和水蒸气蒸馏萃取肉桂油和的羟基自由基清除能力的IC50进行计算，结果分别为0.17 mg/mL（无溶剂微波萃取肉桂油）、0.22 mg/mL（水蒸气蒸馏萃取肉桂油），表明无溶剂微波萃取肉桂油的羟基自由基清除效果明显强于水蒸气蒸馏萃取肉桂油。

图10 不同方法萃取肉桂油对羟基自由基的清除作用Fig.10 Scavenging activity of cinnamon oil extracted by different methods on hydroxyl radicals

3 结论

3.1 采用无溶剂微波萃取工艺对肉桂油进行萃取，并利用正交试验进行工艺优化，得到最佳试验条件：提取时间60 min、微波功率450 W、含水率60%、浸润时间2.5 h。萃取的肉桂精油为橙黄色油状液体，具有浓郁香味，精油得率为3.15%，较传统的水蒸气蒸馏法提高了 35.78%。利用气象色谱/质谱法对肉桂精油成分进行分析，从无溶剂微波萃取肉桂油中鉴定出24种物质，占挥发性成分 91.63%，主要成分为烯类 10种、酯类3种、醇类4种、醛类4种及其它化合物3种，按含量数值从大到小依次为：(E)-肉桂醛（67.69%）、丁香酚（11.36%）、芳樟醇（4.26%）、柠檬烯（2.40%）等。无溶剂微波萃取肉桂油中的肉桂醛及柠檬烯含量较水蒸气蒸馏萃取肉桂油分别提高了14.49%和34.51%，表明无溶剂微波萃取肉桂油有更强的药理活性。扫描电子显微镜 SEM 观察到无溶剂微波萃取后的肉桂样品有明显的空隙和大量不规则的空腔结构，更有利于肉桂油的产出。无溶剂微波萃取肉桂油对DPPH·和羟基自由基清除作用的IC50分别为2.10 mg/mL和2.37 mg/mL，均优于传统水蒸气蒸馏法萃取肉桂油的0.17 mg/mL和0.22 mg/mL。

3.2 无溶剂微波萃取工艺是一种高效、清洁、无污染和无残留的提取技术，可作为传统水蒸气蒸馏法提取肉桂油的替代工艺。与传统水蒸气蒸馏法相比，无溶剂微波萃取工艺有效避免了溶剂的消耗和可能产生的环境污染，同时降低了肉桂油成分中含氧化合物的水解并有效提高了肉桂油得率。本研究为进一步开发以肉桂为原料的天然香料和植物精油防腐剂等提供了数据支撑。