紫外光对米酵菌酸的降解效果及动力学分析

胡均鹏，梁明，陈荣桥，冼燕萍，吴玉銮，侯向昶，戴航，王斌，王莉

（广州质量监督检测研究院，广州市食品安全风险动态监测与预警研究中心，广州市食品安全检测技术重点实验室，广东广州 511447）

米酵菌酸（Bongkrekic acid，BA）是由椰毒假单胞菌酵米面亚种产生的一种可以引起食物中毒的脂类毒素[1,2]，分子式为C28H38O7，结构上含有2个不对称中心的长碳链、1个非共轭烯烃、2个共轭二烯烃、1个甲氧基和3个羧酸（其中C2=C3上两个羧基为反式排列，结构式见图1）。变质银耳、木耳、酵米面食品等易受其污染，食用了这些被污染的食品会引发恶心、呕吐、休克等中毒症状，严重可以导致死亡[3-5]。研究表明 BA主要是作用于线粒体膜，与腺嘌呤载体ANT(电压依赖性阴离子通道)的结合成为 ANT的特异性非竞争性抑制剂，阻碍了ADP与ATP在线粒体内膜的交换，使ATP生成减少或消失，导致细胞凋亡、损伤[6-8]。国内外时有BA的中毒事件发生，2018年和2020年广东发生了多起因食用“湿河粉”而引发BA中毒致死事件[9-11]，2019年莫桑比克发生了非洲首例因饮用由玉米粉发酵制得的传统非洲饮料引起200多人中毒和 75人死亡[12]，引起社会高度关注，也成为研究的热点。因此，研究BA降解减毒的动力学机理，可为开发食品中BA的去毒方法和制定风险防控措施提供理论基础。

图1 米酵菌酸的结构式Fig.1 The structural formula of bongkrekic acid

针对毒素去毒脱毒的方法主要有物理法（紫外照射、活性碳吸附等）、化学法（碱处理、臭氧处理等）和生物法（微生物吸附、微生物降解等）[13-15]，各有其特点。其中紫外照射技术具有高效、污染少、操作简便等特点，被广泛用于生物毒素、农药等有害化合物的光化学降解。王雅玲等[16]研究表明在最佳紫外照射条件下，可以有效消减鱼干中真菌毒素。余以刚等[17]研究表明，用臭氧及紫外线处理，可在短时间内有效降低受污染面粉中DON含量，且对面粉品质无显著影响。卢海清等[18]研究表明紫外照射处理能有效降解苹果汁中展青霉素。目前，采用紫外照射使BA去毒脱毒的文献报道很少，主要是八、九十年代的一些研究，如陈晓明等[19]用日晒法去除银耳中 BA，俞世荣等[20]用紫外线照射研究BA的去毒，通过测定抑菌圈的大小进行判断，未见对BA紫外降解动力学进行研究。因此，本研究以BA-甲醇水体系模型，考察紫外光照强度、BA溶液初始浓度、液层厚度对BA紫外降解的影响，初步探讨BA的紫外降解效果和动力学过程。旨在为BA的去除提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（Orbitrap HRMS）：Q Exactive Focus型，美国 Thermo Fisher Scientific公司；超高效液相色谱（HPLC）：Ulimate 3000型，美国Thermo Fisher Scientific公司；电子分析天平：德国赛多利斯公司；N-EVAP112水浴氮吹仪，美国OA公司；KDC-40低速离心机，安徽中科中佳公司；MS3 digital涡旋混合器，IKA公司；KQ-500E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；紫外灯（功率30 W，波长：254 nm）；紫外灯辐照计，北京师范大学光电仪器厂。

米酵菌酸标准品（1 mg/mL，Tris溶液，纯度96.9%），上海 ANPEL公司；甲醇（HPLC），德国Merk公司；乙腈（HPLC级），德国Merk公司；甲酸（HPLC级），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；超纯水（18.2 MΩ·cm），实验室Milli-Q自制。

1.2 标准溶液配制

准确移取100 μL米酵菌酸标准品，用甲醇定容于10 mL容量瓶，配制成10 μg/mL米酵菌酸标准储备液，于-18 ℃保存。临用HPLC-Orbitrap HRMS检测时，用甲醇-水（5:5，V/V）配制成1、2、5、10、20、50、100 μg/L系列浓度的BA标准工作液，现用现配。

1.3 紫外照射降解试验

照射实验前，先将紫外灯（波长 254 nm）预热30 min，使光源达到稳定辐射。取一定浓度的BA标准溶液2.5 mL于石英培养皿中，置于紫外灯下不同距离进行照射。分析不同紫外照射强度（71 μW/cm2、106 μW/cm2、184 μW/cm2）、不同 BA 初始浓度（1.0、2.5、5.0 μg/mL）、不同液层厚度（2、4、6 mm）下分别照射 0、10、20、30、40、50、60、90、120 min 的BA含量，同时设空白对照组。

利用 HPLC-Orbitrap高分辨质谱采集的全谱信息，对BA紫外降解规律进行了初步探索。

1.4 米酵菌酸含量的检测

1.4.1 色谱条件

BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱程序为：0.0~3.0 min，50%~70% A；3.0~3.6 min，70%~95% A；3.6~5.5 min，95% A；5.5~5.6 min，95%~50% A；5.6~7.0 min，50% A。流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

1.4.2 质谱条件

电离方式为电喷雾负离子（ESI-）模式，喷雾电压为3.0 kV，毛细管温度为320 ℃，辅助气为10 arb，鞘气为45 arb，碰撞能量（NCE）为10%，采集模式为全扫描触发二级质谱扫描（触发扫描离子为m/z485.25485）。Full MS分辨率设为7000，质谱扫描范围为50~550m/z，dd/MS2的分辨率采用17500 FWHM，自动增益控制目标离子数（AGC）设为1.0 e5，IT设为50 ms。米酵菌酸的特征离子为m/z485.25485（定量离子）、m/z441.26489和m/z397.27359。

1.5 计算与统计方法[18]

米酵菌酸降解率：

反应速率表达式为：

对于一级动力学反应，其动力学方程和半衰期分别为：

式中，C0和Ct分别为BA的初始浓度和t时刻时的残存浓度，k为光解速率常数。

1.6 数据处理

所有试验做3次平行，采用Origin 9.0软件进行作图，采用SPSS 22.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 BA线性方程与定量限

用HPLC-Orbitrap HRMS检测系列浓度BA标准溶液，以BA的质量浓度为横坐标，定量离子提取色谱峰面积为纵坐标，得到标准曲线为y=227755x+6789，R2=0.9995，定量限为 1 μg/L。

2.2 紫外照射处理对BA降解效果的影响

2.2.1 紫外照射强度对BA降解效果的影响

在BA初始浓度为2.5 μg/mL，液层厚度为2 mm，分析不同紫外照射强度和照射时间下 BA的降解效果。由图2可知，紫外照射能有效降解BA，在3种照射强度下，BA的降解率与时间呈一定的正相关，均随着照射时间的延长，降解效果提高，3种紫外强度照射10 min时，BA降解率为64.36%~70.88%，照射120 min时，BA降解率为92.02%~96.82%。在相同的照射时间下，紫外照射强度越大，降解效果越好，照射时间为10 min时，最低紫外强度（71 μW/cm2）下BA降解率为64.36%，紫外强度增加至106 μW/cm2和 184 μW/cm2时，BA 降解率分别为 67.63%和70.92%。说明当紫外强度越大、照射时间越长时，BA的降解效果越好。

图2 紫外照射强度对BA降解效果的影响Fig.2 Effect of UV intensity on degradation of bongkrekic acid

用一级动力学方程对不同紫外照射强度下BA的降解情况进行拟合，其光解方程、半衰期、速率常数、相关系数见表1。可见，其相关系数在0.9812~0.9954之间，线性拟合较好。表明BA的降解过程与照射强度能较好符合一级动力学假设，且随着紫外照射强度的增大，BA降解速率常数增大，半衰期缩短。

表1 不同紫外照射强度下BA降解的动力学方程Table 1 Kinetic equations of UV degradation of bongkrekic acid under different UV intensity

2.2.2 不同BA初始浓度的紫外降解效果

在紫外强度为71 μW/cm2，液层厚度为2 mm时，分析不同BA初始浓度下紫外降解情况，由图3可知，当BA浓度为1 μg/mL，照射时间为10 min时，BA的降解率为68.01%，照射时间不变，当BA初始浓度增加至2.5 μg/mL、5.0 μg/mL时，BA的降解率依次下降为64.36%和49.01%，表明在相同照射时间下，BA初始浓度与其降解率呈一定的负相关，即BA初始浓度越低，其降解率越高。BA初始浓度相同时，随着紫外照射时间的延长，BA降解率逐步提高，当照射时间在120 min时，3种初始浓度的BA降解率为92.02%~96.82%。

图3 初始浓度对BA紫外降解效果的影响Fig.3 Effect of initial concentration on degradation of bongkrekic acid

用一级动力学方程对不同初始浓度下BA的降解情况进行拟合，其光解方程、半衰期、速率常数、相关系数见表2。可见，其相关系数在0.9816~0.9954之间，线性拟合较好。表明BA的降解过程与初始浓度能较好符合一级动力学假设；且随着BA初始浓度的增大，BA降解速率常数减少，半衰期延长。

表2 不同初始浓度下BA紫外降解的动力学方程Table 2 Kinetic equations of UV degradation of bongkrekic acid under different initial concentration

2.2.3 不同液层厚度对酵菌酸降解效果的影响

在紫外强度为 71 μW/cm2，BA 初始浓度为 2.5 μg/mL时，分析不同液层厚度的BA的降解效果。由图4可知，BA液层厚度与其降解率呈一定的负相关。当液层厚度为2 mm时，照射时间10 min，BA降解率为64.36%；照射时间不变，液层厚度增加至4 mm和6 mm时，降解率分别降为62.45%和60.01%。在液层厚度相同的情况下，BA降解率与紫外照射时间呈正相关，3种液层厚度经紫外照射10 min时，BA降解率约为60%，照射120 min时，3种液层厚度（由厚到薄）BA降解率分别为83.53%、88.96%和94.17%。说明液层厚度越薄，BA的降解效果越佳。

图4 液层厚度对BA降解效果的影响Fig.4 Effect of layer thickness on degradation of bongkrekic acid

用一级动力学方程对不同液层厚度下BA的降解情况进行拟合，其光解方程、半衰期、速率常数、相关系数见表3。可见，其相关系数在0.9624~0.9954之间，线性拟合较好。表明BA的降解过程与液层厚度能较好符合一级动力学假设；且随着BA液层厚度的增大，BA降解速率常数减少，半衰期延长。

表3 不同液层厚度下BA紫外降解的动力学方程Table 3 Kinetic equations of UV degradation of bongkrekic acid under different layer thickness

2.2.4 BA降解主要因素的回归分析

用SPSS软件中的方差分析研究BA降解各个因素的显著性，结果显示，紫外照射强度、BA初始浓度、液层厚度3个影响因素的p依次为0.000、0.006、0.005，均小于0.05，表明这3个因素对紫外降解BA的影响显著。用回归分析建立各因素与光解速率常数的单独模型见表4，在此基础上，用多元线性回归方法建立紫外照射强度（X1）、BA 初始浓度（X2）、液层厚度（X3）与紫外照射常数 k（Y）的综合模型，回归方程为Y=0.023+3.347×10-5X1-0.01X2-0.03X3，模型拟合度为 R2=0.972，回归方程 F=58.049，p=0.000<0.01，说明回归方程非常显著，其中自变量X1、X2、X3的 t检验分别为 0.011、0.013、0.000，表明紫外照射强度、BA初始浓度、液层厚度对BA光解速率常数的影响显著。由模型方程可知，当紫外照射强度越大、BA溶液初始浓度越低、液层厚度越小，BA紫外降解速率越快。

表4 BA紫外降解各影响因子的回归分析Table 4 Regression analysis of the factors affecting the UV degradation of bongkrekic acid

现有相关文献中，陈晓明等[19]利用阳光中的紫外线作用，通过日晒去除银耳中米酵菌酸，日晒两天可去毒 95%~97%。本研究利用紫外灯（光强为 187 μW/cm2）照射2 h，米酵菌酸降解率可达到96%，相比日晒法，紫外灯强度更集中，脱毒效率更高。俞世荣等[20]研究表明，随紫外线照射BA的时间延长，含有0.4 g毒素的滤纸片所形成的抑菌圈逐渐缩小，表明紫外线照射有去毒效果，但没有对BA紫外降解动力学进行研究。本研究发现米酵菌酸紫外降解符合一级动力学方程，这与卢海清等[18]研究获得的苹果汁中展青霉素的紫外降解规律类似。

3 结论

本实验结果表明，紫外照射能有效降解 BA，且BA紫外降解符合一级动力学方程；随着照射时间的延长，BA和IBA分别再进一步降解，毒性再进一步降低。显著性分析结果表明，紫外照射强度、初始浓度、液层厚度对BA的降解均有显著影响。建立了紫外照射强度、初始浓度、液层厚度与BA紫外降解速率常数的综合回归方程：Y=0.023+3.347×10-5X1-0.01X2-0.03X3，模型拟合度为R2=0.972，回归方程显著。本研究为探索食品中BA的紫外降解去毒提供了理论基础。