壳聚糖型SO2缓释材料的制备及性质表征

杨晓君，周静，谢元，王秋平，丁泽人，赵立艳，金鹏

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）（2.新疆果品采后科学与技术重点实验室，新疆乌鲁木齐 830052）（3.南京农业大学食品科学技术学院，江苏南京 210000）

壳聚糖是一种广泛存在于自然界中的可再生、无毒副作用、生物相容性和降解性良好的天然氨基多糖，其自身及其衍生物具有许多独特的生理、药理功能性质，被广泛应用于医药[1,2]、食品[3-6]、农业[7]等多种行业领域中。壳聚糖的水溶性和成膜性一直是限制其在保鲜上应用的关键问题[8,9]，其吡喃环上含有活泼的-OH、-NH2，在N或O上可引入其他活性基团，改善其溶解性和生物活性；还可以利用O或N原子的孤对电子配位抑或利用交联剂交联以致产生新的活性功能和新的材料特性；拓展壳聚糖及其衍生物的应用领域以及壳聚糖的配位化学研究，开展壳聚糖及其衍生物金属配合物的制备[10]、结构[11]、理化性质[12]和功能活性研究[13]是重要的研究方向之一。近年来，壳聚糖在不同领域的应用研究日益增多，并且都取得了一定的进展，各学科的相互渗透与交叉，不断拓展了壳聚糖的改性方法，提高了壳聚糖的生物活性，同时赋予其更多功能。壳聚糖改性产物已经在果蔬保鲜[14]、纺织[15]、环境微生物污染防治[16,17]、患者周围神经损伤修复[18]等方面展现出了很好的应用前景，各种改性方法的不断改进是壳聚糖发挥重要作用的基础保障。

SO2保鲜是葡萄贮藏化学保鲜的主要方法[19]，传统的SO2处理保鲜是使用亚硫酸盐潮解释放出SO2气体，若总投放量低则保鲜效果不佳；若总投放量高则会出现SO2残留高、葡萄易漂白的现象[20]。因此，亟需开发SO2残留少、使用方便、释放稳定的SO2葡萄保鲜剂以满足当下葡萄采后保鲜的市场需求。近年来，国内外学者开发出多种葡萄贮藏保鲜技术，如贾晓昱等[21]采用脉冲式防腐设备精准定量控制SO2循环熏蒸，贮藏180 d时，腐烂率仅为3.9%，漂白指数为0.3，且SO2残留量为3.1 mg/kg。焦旋等[22]研制的二氧化硫精准释放葡萄保鲜片皆在追求低残留和稳定释放的SO2保鲜技术。

本研究以壳聚糖为主要原料，选择能在食品上应用的、安全性高的有机金属盐，利用金属离子络合配位法对壳聚糖改性，制备具有SO2催化释放中心的壳聚糖骨架分子A。一方面以胶体硫、二氯代烷烃与多硫化钠反应制得的聚硫胶为硫化剂对 A进行硫化浅交联及壳聚糖分子骨架硫化掺杂，形成含硫壳聚糖骨架大分子B，作为葡萄保鲜贮藏前期较高浓度SO2缓释剂；另一方面将A作为包埋剂，选择非水极性溶剂分散共混、固相捏合、两相高速剪切分散对亚硫酸盐、焦亚硫酸盐[23]进行包埋，制备改性壳聚糖SO2缓释包埋产物C，作为葡萄保鲜贮藏中后期SO2平稳长效缓释剂；最后采用高速剪切法将B与C混合，乙醇/丙酮沉淀制备壳聚糖型SO2缓释材料。本研究选择用安全性高的金属离子改性壳聚糖结合传统的亚硫酸盐包埋制作能够缓释SO2的材料相对于其他产品增加了一定抑菌性以及缓释SO2的效果。CS-SO2SM制作工艺如下。

依据上述制备工艺，筛选金属离子和硫化剂，应用析因实验设计，以SO2释放量、释放曲线及抑菌圈直径为综合考察指标，通过场发射环境扫描电子显微镜-能谱仪对其形态进行观察，傅里叶红外光谱仪考察其官能团的变化，确定壳聚糖型SO2缓释材料制备工艺，为后续将该材料应用于葡萄保鲜提供物质和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖（脱乙酰度97%），江苏瑞多生物有限公司；焦硫酸钠（分析纯），天津市光复精细化工研究所；硫代硫酸钠（分析纯），天津市北联精细化学品开发有限公司；四硫化双五亚甲基秋兰姆（TRA，纯度≧98%）、二硫化四甲基秋兰姆（TMTD，纯度≧98%），上海麦克林生化科技有限公司；沉淀硫（化学纯），天津市福晨化学试剂厂；灰葡萄孢，北纳创联生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Quanta 250-EDS场发射环境扫描电子显微镜，美国FEI仪器公司；Nicolet 6700傅立叶变换红外光谱仪，赛默飞世尔科技公司；85-2控温磁力搅拌器，江苏金怡仪器科技有限公司；XH-D旋涡混合器，上海左乐仪器有限公司；pHS-3E酸度计，天津市赛得利斯实验分析仪器制造厂。

1.3 实验方法

1.3.1 CS-SO2SM制备工艺的考察

1.3.1.1 金属离子筛选

按照课题组壳聚糖型 SO2缓释材料的制备方法[24]，以50和150 ku壳聚糖为原料，硫化剂为四硫化双五亚甲基秋兰姆（TRA），设定金属离子为Cu2+、Zn2+，采用碘量法测定SO2释放量，连续测定60 d，选出合成CS-SO2SM的最佳金属离子。

1.3.1.2 硫化剂筛选

以50和150 ku壳聚糖为原料，金属离子为1.3.1.1实验选出，设定硫化剂为TRA、二硫化四甲基秋兰姆（TMTD），同1.3.1.1方法测定SO2释放量，选出合成CS-SO2SM的最佳硫化剂。

1.3.2 析因实验优化CS-SO2SM制备工艺

前期研究结果表明，硫化剂和焦亚硫酸钠用量、含硫壳聚糖骨架大分子B与改性壳聚糖SO2缓释包埋产物C的混合时间对SO2释放的影响较大，所以采用3因子3水平的完全析因实验设计，以SO2释放曲线、释放天数为主要考察指标，进行综合评分，优化CS-SO2SM制备工艺，综合评分公式如下：

综合评分=SO2释放曲线占50分+SO2释放天数占50分

（1）SO2释放曲线评分方法：先上升后逐渐下降较为符合葡萄保鲜的曲线记为4~5分，基本符合记2~3分，有SO2释放记0~1分。

（2）SO2释放天数评分方法：总释放天数为40 d，释放天数/40×5。

3×3 ×3 析因实验因素水平表见表1，完全的3×3×3析因实验共进行 27次实验，以确定每个因素的贡献率。

表1 3×3×3析因实验因素水平表Table 1 3×3×3 Factorial experimental factor level

1.3.3 CS-SO2SM的结构表征

1.3.3.1 场发射环境扫描电子显微镜

取0.5 mg样品置于样品舱中，在压力130 Pa，保压时间30 μs下进行检测分析。

1.3.3.2 红外光谱检测

将样品与溴化钾按质量比1:100充分混合压制溴化钾片，置于样品室中进行检测分析。

1.3.4 SO2释放量测定

按照如下方法测定在室温环境下每天释放的SO2变化量及变化趋势：将1 g样品置于磨口锥形瓶中，室温放置48 h后取出，然后在磨口锥形瓶中迅速加入去离子水100 mL和10.5 mol/L NaOH溶液1 mL，放置30 min，淀粉指示剂2 mL，0.1 mol/L碘标准液滴定，记录体积，计算SO2释放量，同法做空白实验。公式如下：

式中N为碘标准溶液的浓度（mol/L）；V1为滴定试样时消耗的碘标准溶液的体积（L）；V0为滴定空白试样消耗的碘标准溶液的体积（L）。

1.3.5 抑菌实验

参考了Tan等[25]的方法并加以修改，采用析因实验的结果选取较优配方，使用灰葡萄孢菌进行抑菌试验。

1.3.5.1 菌悬液的制备

使用菌用接种环挑取少许菌落置于装有无菌水的试管内，涡旋混匀，制成菌悬液，待用。

1.3.5.2 抑菌圈实验

取直径6 mm的灭菌滤纸放入不同配方、相同浓度的保鲜剂（1%甲酸溶液作溶剂）中浸泡。取上述菌悬液40 µL均匀涂布于培养基，用无菌镊子将浸有保鲜剂溶液的滤纸贴于培养皿中，每个培养皿贴4片，并用浸有1%甲酸溶液的滤纸作对照，在28 ℃恒温培养箱中培养。7 d后取出观察并测定其抑菌圈直径。

1.4 统计学分析

实验结果用均值±标准差（¯X+SD）表示，用SPSS 21.0版统计软件中的多因素方差分析进行统计学处理，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。用Origin9.1作图软件进行图形绘制。

2 结果与讨论

2.1 金属离子对CS-SO2SM释放SO2的影响

14.6 ℃，最大湿差为25%。由图1可知，Cu2+合成的CS-SO2SM释放曲线呈先上升后下降的趋势，在第4 d释放量最大，其释放量为31.36 mg/g，5~60 d呈现缓慢下降的趋势，并且整个释放过程中SO2的释放量随着环境温湿度的改变较为稳定；Zn2+合成的CS-SO2SM释放曲线在第40 d释放量最大，其释放量为32.64 mg/g，在整个释放过程中SO2的释放量随着温湿度的改变而出现忽高忽低的现象较多，其中有16 d无SO2的释放。通过对比上述两种金属离子络合产物SO2的释放曲线可知，选择Cu2+对络合配位改性壳聚糖合成CS-SO2SM，其SO2释放曲线符合葡萄保鲜曲线特征[26]。

图1 不同金属离子缓释材料的SO2释放量Fig.1 SO2 release from different metal ion sustained-release materials

2.2 硫化剂对CS-SO2SM释放SO2的影响

由图2可知，TRA合成的CS-SO2SM释放曲线有先上升后下降的趋势，第4 d释放量最大，其释放量为18.56 mg/g，5~60 d呈现缓慢下降的趋势；TMTD合成的CS-SO2SM释放曲线呈现忽高忽低的现象，其中有18 d无SO2的释放。通过对比上述两条SO2的释放曲线可知，在使用 Cu2+络合配位改性壳聚糖时，TRA合成的CS-SO2SM更加稳定且能持久释放SO2。

图2 不同硫化剂缓释材料的SO2释放量Fig.2 SO2 release from different sulfur release agents

2.3 析因实验结果

由表2可知，最大的综合值为10，其对应的组合水平是A3B3C2，即TRA加入量0.5 g、焦硫酸钠加入量0.5 g与混合搅拌时间1.5 h的制备工艺为最佳。

表2 综合评分表Table 2 Scoring table

由表3可以看出，TRA加入量，焦亚硫酸钠加入量和混合搅拌时间对 SO2释放量的影响极显著（p<0.01），且三者均有显著交互作用（p<0.01）。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

壳聚糖可通过化学法、物理法及生物方法等改性[27-29]，本研究利用析因实验法对硫化改性的壳聚糖配方进行优化。析因实验设计主要用于分析各因素和交互作用，寻找最佳组合。从实验结果可知，TRA加入量，焦亚硫酸钠加入量和混合搅拌时间对CS-SO2SM制备有显著影响，通过析因实验得到最佳制备工艺为50和150 ku壳聚糖1 g溶于甲酸溶液中，磁力搅拌下滴加与壳聚糖等摩尔质量的硫酸铜溶液，搅拌 3 h，加氨水调pH至6左右继续搅拌3 h，即得产物A；然后加入0.5 g TRA沉淀硫混合物（1:1）和1 mL乳化剂，60 ℃搅拌1 h即得产物B；产物A中加入0.5 g硫代硫酸钠、0.5 g焦硫酸钠和1 mL乳化剂，60 ℃搅拌1 h，即得产物C；最后将产物B与C按1:1（V/V）混合，60 ℃搅拌1.5 h，加入乙醇/丙酮（1:1，V/V）混合溶液，放置，抽滤，沉淀物用75%、95%、100%乙醇依次洗涤，60 ℃烘干，即得CS-SO2SM。

2.4 CS-SO2SM的结构表征

材料表征主要分为元素分析、分子与固态分析、表面表征技术，常用的检测方法有原子吸收光谱、X-衍射、红外光谱、拉曼光谱、热分析、紫外光谱、电子显微镜等[30,31]，本研究应用红外光谱、场发射扫描电子显微镜-能谱仪进行结构表征。

2.4.1 场发射环境扫描电子显微镜-能谱检测

在扫描电镜下，合成中间产物A（图4）与壳聚糖原料（图3）相比较，A不再是常见壳聚糖高分子无定形玻璃态，而是转化为类半结晶性的团粒状，这可能是因为经过 Cu→N配位后改变了壳聚糖链的极性，利于结晶。产物B（图5）的形态从A的半结晶态转化为类低聚橡胶常表现出的片絮状结构，产物B是在产物A基础上进一步交联硫化的结果。产物C（图6）是产物A将硫酸盐包埋，结构上类似于产物A，CS-SO2SM为半结晶与片絮状的无定混合态，这与终产物即是产物B与产物C共混的结果相关。

图3 壳聚糖电镜图（3000×）Fig.3 Chitosan electron micrograph (3000×)

图4 产物A电镜图（3000×）Fig.4 Electron micrograph of compound A (3000×)

图5 产物B电镜图（3000×）Fig.5 Electron micrograph of compound B (3000×)

图6 产物C电镜图（3000×）Fig.6 Electron micrograph of compound C (3000×)

产品CS-SO2SM为黑褐色固体粉末（图7）。由壳聚糖原料合成壳聚糖型 SO2缓释材料的各中间产物，在电镜下的形态发生了相应的改变（图8）。由能谱仪元素分析（图9）可知，C、O、Cu、S的原子含量分别是 69.68%、22.70%、2.92%、4.70%；归一化质量分别是54.48%、23.65%、12.07%、9.81%。

图7 CS-SO2SMFig.7 Chitosan type SO2 sustained material

图8 CS-SO2SM电镜图（3000×）Fig.8 Electron micrograph of CS-SO2SM (3000×)

图9 CS-SO2SM能谱图Fig.9 CS-SO2SM spectrum

2.4.2 红外光谱检测

CS-SO2SM红外光谱图中（图10），与50、150 ku壳聚糖相比，壳聚糖的特征吸收峰峰Ⅰ（-OH和-NH伸缩振动吸收峰）、峰Ⅱ（C-H伸缩振动吸收峰）和峰Ⅲ、Ⅳ（酰胺吸收峰）均出现[32]，并发生不同程度的蓝移，且透过率明显增大，这是Cu→N配位产生吸收峰向高波数移动的结果。综合扫描电镜-能谱仪和FT-IR分析，结果表明成功合成了以壳聚糖为骨架的缓释材料CS-SO2SM。

图10 CS-SO2SM红外光谱Fig.10 Infrared spectrum of CS-SO2SM

2.5 抑菌实验

通过析因实验选取三个较优配方做抑菌试验。由表4可知，三者均有抑菌作用，其中26号（A3B3C2）抑菌圈最大（p<0.01），抑菌性能为最佳，与析因实验结果基本一致。

表4 抑菌效果Table 4 Bacteriostatic effect

3 结论

本研究选用壳聚糖为原料，采用金属离子配位反应、硫化反应和包埋技术通过共混、交联制备了壳聚糖型 SO2缓释材料。通过单因素试验筛选出 Cu2+与TRA分别作为金属离子和硫化剂，3×3×3析因实验对制备工艺进行优化，确定了适合该材料的配方为TRA 0.5 g、焦亚硫酸钠0.5 g、搅拌1.5 h。综合扫描电镜-能谱仪和FT-IR分析，CS-SO2SM是以壳聚糖为骨架，经过铜离子配位反应、胶硫化和硫酸盐包埋形成的黑褐色固体粉末。抑菌实验表明抑菌圈平均直径为20.33 mm，具有最佳抑菌效果，与析因结果相同。本研究中制备的CS-SO2SM的SO2释放曲线具备葡萄保鲜曲线特征，有望成为一种新型SO2保鲜剂。