芝麻香型与浓香型白酒固态发酵过程中氨基甲酸乙酯的形成研究

李拥军，陈雯，皮小弟，邬婷，周凯

（1.广东江门中医药职业学院南药学院，广东江门 529000）（2.黄埔海关技术中心，广东广州 510730）（3.九江学院江西油茶研究中心,药学与生命科学学院，江西九江 332005）

白酒是“世界八大烈酒”之一，由于其独特的风味和悠久的饮酒文化，深受我国广大消费者的青睐。然而饮酒时也可能摄入一些有害物质，如氨基甲酸乙酯（EC），一种 2A类的致癌物（国际癌症研究机构，IARC，2007），普遍存在于发酵食品与酒精饮料中[1]。针对饮酒摄入的高风险水平的 EC，许多国家已经制定了严格的限量标准，例如加拿大和捷克规定谷物蒸馏酒中EC含量不得超过150 μg/L[2]。近年来发现，我国的部分地区白酒中EC含量超过了这一水平，最大含量高达1680 μg/kg，严重影响了我国白酒的世界化进程，危害了消费者健康[3-5]。因此，降低白酒中 EC含量势在必行。

迄今为止，饮料酒中的EC形成途径已有基本定论，主要是在生产过程中通过前体物质与乙醇发生反应形成EC，目前发现的EC前体有：尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、焦碳酸二乙酯和氰酸[2,6]。不同香型白酒的生产工艺各异，但均需要经过发酵和蒸馏两个步骤，现有研究表明尿素和瓜氨酸均显著影响EC形成[7,8]。在蒸馏过程中，高温显著促进了前体物质与乙醇反应形成EC；加上白酒“越酿越香”，贮藏时间长，也会形成大量的 EC，因此许多研究集中在揭示蒸馏与贮藏过程中EC形成规律[9-11]。然而，前体物质中瓜氨酸与尿素的形成在很大程度上与发酵微生物有关，其中酿酒酵母能够将精氨酸大量转化成尿素，而具有精氨酸脱亚氨基（ADI）途径的细菌则能代谢精氨酸形成瓜氨酸[1,5,6]，二者的积累均主要发生在酒醅发酵过程中。因此，本文选取了浓香型与芝麻香型两种具有代表性的白酒，探究白酒固态发酵过程中EC及其主要前体物质的形成规律，以期为针对性的减少EC含量提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

浓香型和芝麻香型固态酒醅取自安徽某酒厂，酒醅发酵时间跨度为2020年9月至2020年11月之间，由于窖池不同部位发酵差异较大，每次取样时将窖池深度分成四等分，在中间两等分点中靠近窖池中部取样，每个深度中取样三个位置，最后将上述样品混匀，共得约1800 g样品。

氨基甲酸乙酯（EC）、氨基甲酸丁酯（BC）、二氯甲烷、乙腈等色谱纯试剂购买于上海阿拉丁试剂公司，占吨醇、氢氧化钠、尿素、乙醇、瓜氨酸、精氨酸等分析纯购买于天津希恩思试剂公司。

1.2 试验方法

将获取的酒醅样品均分成三份后分装入无菌的自封袋内，密封后置于-20 ℃保藏，待所有酒醅样品收集完成后再立即进行分析。

为了探究酒醅发酵过程中尿素与瓜氨酸对EC形成的影响，取发酵一周后的酒醅样品平均分成2份，每份600 g，一份加入60 mg尿素（即酒醅中尿素含量增加了100 mg/kg），另一份加入24 mg瓜氨酸（即酒醅中瓜氨酸含量增加了 40 mg/kg）。混合均匀各自分成三份后装入棕色试剂瓶中，密封后置于 35 ℃恒温培养箱中培养至窖池样品发酵结束。为了验证酒醅发酵初期pH值对EC形成的影响，将初始发酵酒醅pH值调节成5、4.5、4和3.5（先测定酒醅pH值，利用乙酸/氢氧化钠溶液调节至相应pH值并记录消耗的体积，然后在酒醅中加入相应体积的乙酸/氢氧化钠溶液），分别装入棕色试剂瓶中，密封后置于35 ℃恒温培养箱中培养一周。

1.3 分析方法

1.3.1 氨基甲酸乙酯含量测定

样品前处理参考GB 5009.223-2014并稍做修改。在50 mL离心管中加入5 g样品和50 μL BC内标（1 μg/mL），再加入10 mL蒸馏水和1 g氯化钠，超声溶解混匀，5000 r/min离心5 min，将上清液加样至CNW BOND固相萃取小柱（上海安谱），静置10 min后，先用15 mL正己烷淋洗后，用20 mL 5%的乙酸乙酯-乙醚洗脱，控制洗脱流速1滴/s。将洗脱液收集到离心管后加入2 g无水硫酸钠除水后，室温下用氮气缓缓吹至近干，二氯甲烷定容至1 mL，经0.22 μm的有机滤膜过滤后供GC-MS分析。

采用VF-WAX（30 m×0.25 mm、0.25 μm）色谱柱，气相色谱质谱型号为Agilent 7890A-5975C（美国安捷伦），色谱参数设置为：氦气为载气，流速为1.0 mL/min。进样口和传输线温度分别为220 ℃和250 ℃，气体洗脱程序设置为初始温度50 ℃，保持1 min, 以8 ℃/min加热至 180 ℃后再以 40 ℃/min加热至240 ℃，保持5 min，不分流进样，进样量为1.0 μL。质谱参数设定为：采用EI源，电子能量70 eV，离子源温度为230 ℃。采用SIM模式扫描，特征离子为62、74和89，为了提高灵敏度选择62为定量离子。

1.3.2 乙醇含量测定

取10 g样品置于250 mL锥形瓶中，加入40 mL蒸馏水，充分混合振荡后过滤，收集滤液后离心取上清液待测。乙醇测定采用重铬酸钾比色法[12]：重铬酸钾（2 mL，4%）、浓硫酸（2.5 mL）和1 mL样品加入25 mL比色管中，混合后沸水浴10 min，冷却至室温后利用分光光度计测定600 nm吸光值，通过标准曲线计算乙醇含量。

1.3.3 尿素含量测定

尿素含量采用轻工业行业标准 QB/T 4710-2014进行测定，取1.3.2中上清液待测样品600 μL，加入400 μL的占吨醇（0.02 mol/L，溶于正丙醇）衍生化试剂，并加入100 μL1.5 mol/L的盐酸溶液，漩涡震荡1 min，避光在25 ℃下反应30 min，反应液经0.22 μm有机滤膜过滤后供高效液相色谱法结合荧光检测器分离检测。以保留时间定性，采用峰面积外标法定量。色谱柱选择ZORBAX SB-C18柱，柱温35 ℃，进样量10 μL。荧光检测器激发波长为240 nm，发射波长为308 nm。

1.3.4 精氨酸与瓜氨酸含量测定

瓜氨酸和精氨酸的含量测定参考 Zhou[13]的方法利用分光光度法稍加修改。将40 g/L NaOH、80 g/L甲萘酚和0.5 mL/L双乙酰（用正丙醇溶解）各1 mL加入10 mL比色管中，然后加入100 μL适当稀释的样品（或标准溶液），混匀后在 30 ℃水浴中保温 15 min，冷却室温后测 OD540，对应标准曲线中计算出精氨酸含量。取2 mL稀释的样品（或标准溶液），加入1 mL混合酸（V/V=1:3）和0.125 mL二乙酰一肟（30 g/L），混匀后避光沸水浴30 min，继续避光冷却至室温后利用分光光度计测定490 nm下的吸光值，通过标准曲线计算瓜氨酸含量。

1.3.5 pH值与总酸含量测定

将40 mL蒸馏水与10 g样品置于250 mL锥形瓶中，在25 ℃条件下充分混合振荡20 min，采用pH计测定样品的pH值。将混合振荡的样品过滤，稀释十倍后，吸取50 mL样品于25 mL锥形瓶中，加入酚酞指示剂后，用氢氧化钠标准液滴定，以100 g酒醅消耗的NaOH的毫摩尔数记为度。

1.4 数据处理

使用SPSS 22进行单因素方差分析与双变量相关性分析，确定p<0.05的统计学上的显著性差异与p<0.01的极显著差异。采用OriginPro 8.0进行数据作图。

2 结果与分析

2.1 白酒固态发酵过程中氨基甲酸乙酯的形成

酒醅固态发酵过程中EC含量如图1所示，酒醅发酵初期即检测出可观的EC含量，芝麻香型和浓香型酒醅中分别为29.39 μg/kg和20.37 μg/kg。两种香型酒醅发酵第1周EC含量均未显著变化，随着发酵时间的延长，酒醅中的EC含量逐渐增加。其中浓香型白酒EC形成速率较慢，直到发酵末期才显著增加至76.04 μg/kg，其含量相比于发酵初期增加了272.93%；芝麻香型酒醅在发酵2~4周内EC含量急剧增加，尽管发酵时间较浓香型酒醅短，但芝麻香型酒醅中 EC形成速率（4.40×10-7μmol/kg·s）和含量（140.55 μg/kg）均显著高于浓香型酒醅（图1），也显著高于酱油酱醅与酱香型白酒酒醅[14,15]，但与报道的浓香型白酒酒醅相当[16]。

图1 酒醅窖池发酵与模拟发酵过程中EC含量变化Fig.1 Time-dependent actual and simulated variation in EC concentration of fermenting grains during Baijiu preparation

2.2 白酒固态发酵过程中氨基甲酸乙酯相关前体物质含量变化

乙醇是酒醅发酵主要产物，也是检测酒醅发酵品质的重要指标之一。固态酒醅中乙醇含量随着发酵时间的延长逐渐增加（图2），其中芝麻香型酒醅在发酵3周后乙醇含量达到稳定，为4.52%~4.66%，浓香型酒醅发酵1周后乙醇含量迅速增加至3.25%，随着发酵时间延长缓慢增加至4.02%。经测定，酒醅中水分含量在60%左右，根据乙醇和前体物质的摩尔质量计算，乙醇摩尔质量浓度为瓜氨酸和尿素的102~103倍，即在整个发酵过程中EC形成阶段，乙醇含量均为过量状态。

图2 白酒固态发酵过程中乙醇、精氨酸、瓜氨酸与尿素含量变化情况Fig.2 Ethanol, arginine, citrulline, and urea concentrations over the course of solid-state Baijiu fermentation

浓香型白酒固态发酵过程中游离精氨酸含量呈现波浪式上升趋势（图2），从发酵初期的129.66 mg/kg增加到218.69 mg/kg。而在芝麻香型酒醅中，精氨酸含量在发酵第1周增加至最高（276.98 mg/kg），发酵2~4周内精氨酸含量逐渐降低，经过最后2周发酵精氨酸含量增加至209.46 mg/kg。精氨酸是一种蛋白质氨基酸，游离的精氨酸主要通过蛋白质水解微生物转化获得，EC重要前体物质瓜氨酸与尿素则主要由微生物代谢精氨酸产生[6]。尿素主要通过酵母的尿素循环产生，在氮代谢阻遏效应调控下造成尿素的积累[5,6]。本研究中的两种香型的白酒酒醅中尿素在发酵前3周均显著增加，这与乙醇的积累结果一致（图1）。芝麻香型酒醅发酵末期尿素含量较浓香型酒醅高约25 mg/kg。瓜氨酸含量变化在两种香型酒醅发酵过程中表现不同：在芝麻香型酒醅中，发酵前两周内的瓜氨酸含量持续增加，但在第三周急剧下降，在发酵末期提高至53.56 mg/kg；在浓香型酒醅中，瓜氨酸含量在整个发酵过程中均持续增加，最终含量为 56.67 mg/kg。发酵过程中瓜氨酸的积累主要由具有精氨酸脱亚氨基途径（ADI途径）的细菌代谢精氨酸产生[17]，两种香型酒醅的瓜氨酸在发酵中后期积累较多，研究此发酵阶段的细菌代谢精氨酸规律有利于控制瓜氨酸的积累。

2.3 白酒固态发酵过程中pH值及酸度指标的变化

白酒酒醅固态发酵过程中，水分含量维持在40%~60%，大量特定微生物在此环境中生长代谢，环境中的酸度和pH值对优势菌生长代谢影响很大，是酒醅群落演替中关键推动力[18]。因此，监测酒醅中总酸度与pH值，对于了解发酵安全与品质十分必要。如图3所示，酒醅中总酸度随着发酵时间的延长而升高，pH值则下降。其中芝麻香型酒醅初始总酸度高于浓香型，pH值则低于浓香型酒醅。随着发酵时间延长，浓香型酒醅的总酸度增加速度和pH值下降速度均高于芝麻香型酒醅，但并不同步进行。浓香型酒醅的总酸度在发酵3周后才超过芝麻香型酒醅，而pH值则在第2周内即低于芝麻香型酒醅。值得注意的是，白酒固态发酵1周时pH值均升高，发酵2周后两种白酒酒醅的pH值均维持在4.0以下，这有助于乳酸菌生长代谢[19]，也有助于EC的形成[20]。曹云刚[21]指出酒醅总酸度的变化趋势与pH值大体一致，但并不完全相同，在汾酒酒醅中发酵初期的总酸度增加，pH值反而略有上升，这与本研究中的两种酒醅一致，浓香型白酒总酸度与pH值变化更大。

图3 白酒固态发酵过程中总酸度及pH值变化情况Fig.3 Changes in total acidity and pH over the course of solid-state Baijiu fermentation

2.4 酒醅发酵过程中EC与主要指标相关性分析

芝麻香型和浓香型白酒酒醅固态发酵过程中 EC及其相关指标的相关性分析分别如表1和表2所示，两种酒醅发酵过程中乙醇与总酸度和pH值变化显著相关，这与固态发酵过程中优势微生物生长相关[18]；EC含量与乙醇含量和总酸度在两种酒醅中均呈极显著正相关；尿素与瓜氨酸在芝麻香型白酒固态发酵过程中与EC相关性均不显著（p>0.05）；在浓香型白酒固态发酵过程中EC与瓜氨酸呈极显著正相关，与尿素含量显著相关。以上结果可能的原因有：1）pH值影响瓜氨酸和尿素与乙醇反应形成 EC，本研究中发现两种酒醅pH值在4.0时EC开始显著积累，发酵2周后酒醅pH值接近4.0，尽管前两周瓜氨酸和尿素含量均有增加，但EC积累呈现滞后趋势；2）由于酒醅发酵温度较低（酒醅温度为32 ℃~38 ℃），瓜氨酸与尿素形成EC的转化率极低（约10-3），前体物质的变化并不全部形成EC；3）酒醅为固态发酵，水分含量约50%，大部分只是浸润发酵基质，并不形成一个连续的溶剂环境，导致部分微生物代谢形成的前体物质并不能迅速转化成 EC。在两种酒醅发酵过程中精氨酸与瓜氨酸的含量均呈极显著相关，而与尿素相关性不显著。尿素可从发酵原料中带入，也能通过精氨酸转化形成；而瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，主要通过微生物代谢产生[5,6]。近年来随着对瓜氨酸积累关键发酵细菌的深入研究，有望通过调节精氨酸代谢来降低瓜氨酸含量，进而控制EC积累。

表1 芝麻香型白酒固态发酵过程中EC、乙醇、尿素、精氨酸、瓜氨酸、总酸度和pH值之间的相关性分析Table 1 Correlation coefficients between EC, ethanol, urea, arginine, and citrulline contents, total acidity, and pH during grain fermentation in sesame-flavored Baijiu

表2 浓香型白酒固态发酵过程中EC、乙醇、尿素、精氨酸、瓜氨酸、总酸度和pH之间的相关性分析Table 2 Correlation coefficients between EC, ethanol, urea, arginine, and citrulline contents, total acidity, and pH during grain fermentation in strongly flavored Baijiu

2.5 pH值、尿素与瓜氨酸对白酒固态发酵过程中氨基甲酸乙酯形成的影响

为了深入验证发酵初期pH值对EC积累的影响并探究发酵过程中尿素与瓜氨酸形成EC的能力，将发酵初期酒醅pH值调节成3.5~5，另在发酵1周的酒醅中添加尿素与瓜氨酸（添加含量为酒醅发酵阶段尿素与瓜氨酸含量平均值的近似值，分别为 100 mg/kg尿素与40 mg/kg瓜氨酸）后，进行模拟发酵，其结果见图1与图4。如图1所示，添加了尿素与瓜氨酸后，两种酒醅随着发酵时间的延长，处理组中EC含量均显著高于对照组。假设添加的瓜氨酸与尿素只参与EC形成，则瓜氨酸与尿素在芝麻香型酒醅中转化率（增加的EC物质的量/添加的尿素或瓜氨酸物质的量）分别为4.43×10-4和2.50×10-4，在浓香型酒醅中转化率分别为5.85×10-4和2.06×10-4，即瓜氨酸在酒醅中转化成EC能力高于尿素。但实际上，尿素与瓜氨酸不只参与形成EC，且酒醅中尿素含量远高于瓜氨酸（图2），尿素处理组形成的 EC含量均显著高于瓜氨酸添加组。在添加尿素与瓜氨酸后3周后，处理组酒醅与对照组酒醅EC含量差值不再增加，在浓香型酒醅中反而有所降低。以上现象表明：1）酒醅中尿素与瓜氨酸均能够促进EC的积累，由于酒醅中尿素含量更高，形成的EC更多；2）尿素与瓜氨酸均由酒醅中部分微生物产生，且浓度远低于乙醇，由于酒醅是固态发酵，酒醅中形成的尿素和瓜氨酸与乙醇反应能力显著弱于在溶液环境中，EC转化率很低；3）在酒醅发酵后期，尿素与瓜氨酸趋于动态平衡，EC的形成逐渐稳定。芝麻香型和浓香型酒醅发酵初始时pH值分别为4.26和4.93，调节酒醅pH值后发酵1周EC含量如图4所示。将两种香型酒醅pH值调节为4.0以下，EC形成量均高于对照组，其中芝麻香型和浓香型酒醅 pH值分别调节为4.0和3.5的处理组在发酵1周后EC含量显著高于初始值、对照组、pH值为5和4.5的处理组。故推断发酵初期pH值可能是影响EC形成的重要因素之一。

图4 pH值对酒醅发酵初期EC形成的影响Fig.4 Effects of pH on EC formation during early stage Baijiu fermentation

3 讨论

我国白酒香型分类较多，生产工艺各异，本文选取了浓香型与芝麻香型两种白酒，分析其酒醅在发酵过程中的EC形成情况。浓香型酒醅由白酒母糟蒸馏后拌曲制备，而芝麻香型酒醅发酵前需要经过高温堆积[22]，图1显示酒醅固态发酵初期就能检测出可观的EC含量，在芝麻香型和浓香型酒醅中含量分别为29.39 μg/kg 和 20.37 μg/kg。根据浓香型生产工艺推测，浓香型酒醅发酵初期 EC主要来源于母糟蒸馏后残留，除去蒸酒后样品中的EC及其前体有利于降低酒醅中EC含量；而芝麻香型酒醅EC来源于高温堆积过程（原料蒸料摊凉后并未检出EC），以堆积时间约3 d 计算，EC 形成速率为1.27×10-6μmol/kg·s，显著高于窖池中芝麻香型酒醅发酵时产生EC的速率。尽管芝麻香型白酒酒醅堆积过程中EC前体物质含量均低于窖池发酵，但酒醅在堆积过程中温度（45~50 ℃）显著高于在窖池中的发酵温度（一般不超过40 ℃），说明温度对EC形成速率影响极大，控制发酵温度是关键。

随着酒醅发酵时间的延长，EC含量逐渐增加，相比于发酵初期，发酵末期的浓香型酒醅和芝麻香型酒醅EC含量分别增加了111.16 μg/kg和55.65 μg/kg，酒醅中的EC很容易在蒸馏过程中转移至白酒中[9,23]。因此研究不同香型酒醅发酵过程中EC变化规律，针对性的控制酒醅发酵过程中EC形成十分必要。本研究中芝麻香型酒醅在发酵过程中积累的EC含量为浓香型白酒醅的近两倍，也普遍高于其他白酒[4,8,21]，需要重点关注。两种酒醅发酵过程EC主要形成期不同，芝麻香型酒醅EC含量在发酵2~4周增加迅速，占总增加量的83.02%；而浓香型酒醅发酵最后10 d EC含量占总增加量的44.06%，为主要积累期。

在不同香型白酒及其生产工艺阶段中，EC主要前体物质有极大差别。梁晨[14]分析了芝麻香型白酒与酱香型白酒在发酵过程中EC与尿素含量变化情况，发现尿素与EC含量变化显著相关，而瓜氨酸含量变化与EC变化不显著，指出尿素是两种香型白酒中EC形成的主要前体物质，林建春[7]的结果也支持该结论，但二者均未通过发酵添加实验去验证。仇钰莹[8]认为原酒中EC的主要前体物质是尿素和瓜氨酸，且酒醅发酵过程中瓜氨酸含量增幅达63.90%。本研究中两种酒醅在发酵过程中瓜氨酸增加量均高于尿素含量，且浓香型白酒酒醅中瓜氨酸与EC含量变化呈极显著相关（图2）。瓜氨酸沸点低于尿素，在白酒实际生产过程中，瓜氨酸对白酒蒸馏阶段与储酒阶段的EC含量的影响不可忽视[10]。在模拟实验中发现，添加的瓜氨酸和尿素均能显著增加酒醅中EC含量，尿素处理组形成的EC含量均显著高于瓜氨酸添加组。

酒醅发酵1周时尿素、瓜氨酸与乙醇含量均显著增加，但EC含量直到第二周才显著增加。分析发现EC与酸度和pH值具有较高的相关性，且发酵1周内酒醅pH值均高于4.0，推测pH值对发酵初期EC形成有影响。目前只有少数研究关注pH值对EC积累的影响，周佳[24]发现低pH值环境下能够阻碍腐乳中EC形成，但在酱油模拟灭菌过程中pH值在5.0以下EC形成显著增加[15]，大多数模拟EC形成条件时均采用pH值为4.5左右的酸性环境[22,23]，推测低pH值环境有助于EC的形成。模拟实验结果显示，酒醅发酵一周后在pH值为4.0和3.5的处理组中EC含量相比于对照组显著增加（p<0.05），而pH值高于4.0则变化不大，故推断pH值可能是影响发酵初期EC形成的重要因素，但在酒醅pH值在4.0和3.5时对EC形成影响不大（图4）。

4 结论

4.1 两种香型白酒酒醅在固态发酵初期均检测到EC，芝麻香型和浓香型白酒酒醅发酵过程中EC积累量远高于发酵初期。酒醅发酵初期EC形成主要受pH值影响，酒醅pH值低于4.0有利于EC的形成。芝麻香型酒醅EC主要积累期为发酵2~4周，占整个发酵过程中EC形成量的83.02%，浓香型酒醅EC主要积累于发酵后期。

4.2 两种香型白酒酒醅在发酵过程中瓜氨酸增加量均高于尿素。尿素在发酵前3周含量显著增加，而瓜氨酸主要积累于发酵后期。在模拟实验中发现，添加的瓜氨酸和尿素均能显著增加酒醅中EC含量，尿素在酒醅发酵环境中转化成EC含量更多。