剁辣椒家常加工对5种农药残留的影响

李凯龙，陈武瑛，陈同强，张 忞，熊志林，王 丹，陈 昂,

（1.湖南省植物保护研究所/湖南省农业科学院环境安全评价中心，湖南长沙 410125；2.湖南省食品质量监督检验研究院，湖南长沙 410111）

食品加工不仅可以改变食品的品质特性，增加食品附加值，还会对食品中农药残留的水平产生影响[1]。在开展膳食中农药残留暴露评估时，考虑加工过程对农药残留的影响，对于正确评估农药的膳食摄入，保障农药暴露风险评估的准确性具有重要意义[1−3]。国内外研究表明蔬菜加工过程能减少农药残留水平，而不同加工过程和加工方式对减少农药残留效果有所不同[4]，包括清洗方式[5]、清洗剂[6]、烹饪方式[7−10]、储存方式[11]和消毒方式[12−14]等对农药残留影响。大多数加工过程可在很大程度上降低食品中的农药残留水平，如清洗、去皮、榨汁等；但有些加工过程，如干燥或浓缩，由于受食品中水分挥发等因素的影响，使得某些农药的残留水平升高[15]。而对于腌制蔬菜的加工过程对于蔬菜农药残留的影响研究较少，特别是无氧环境下的腌制过程。

剁辣椒作为一种典型的无氧腌制加工蔬菜，其传统加工方法是利用乳酸菌的自然发酵和食盐保存作用进行加工处理[16]。剁辣椒的家常加工制作过程为经水洗、去蒂、晾干、切碎的辣椒及辅料放入高盐无氧密封的条件下，利用食盐抑制辣椒生理作用使其熟化，同时利用辣椒表面附着或后来添加的微生物发酵产生独特风味而制成受人喜爱的剁辣椒[17]。国内学者在剁辣椒发酵工艺、发酵微生物、风味品质等方面进行了大量研究[18−20]，但对剁辣椒加工过程中农药残留动态的研究尚未见报道。鉴于此，本研究选择辣椒种植过程中常用的吡虫啉（imidacloprid）、啶虫脒（acetamiprid）、精甲霜灵（metalaxyl-M）、嘧菌酯（azoxystrobin）和苯醚甲环唑（difenoconazole）5种农药（结构式见图1），同时吡虫啉和啶虫脒也是检出率较高的农药[21−22]。通过沉积农药处理后，研究在水洗、晾干、切碎、加盐腌制加工工艺过程中5种农药的残留变化情况及其加工因子，结合农药的理化参数探索加工因子的变化规律。研究结果可为更科学的膳食评估提供基础数据支撑，也可结合农药的理化特性合理指导农药的规范使用和为生产健康安全的辣椒制品提供参考。

图1 5种农药的结构式Fig.1 Structural formulas of 5 insecticides

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试红线椒（Capsicum annuumL.） 购自长沙市农贸市场；5种农药标准品（纯度均大于95%） 购自德国Dr.Ehrenstorfe公司，理化性质见表1；70%吡虫啉水分散粒剂 德国拜耳公司；20%啶虫脒水分散粒剂 河北野田农用化学有限公司；10%苯醚甲环唑水分散粒剂、39%精甲霜灵·嘧菌酯悬乳剂 瑞士先正达公司；乙腈、甲醇 色谱纯，德国MERCK默克公司；氯化钠 优级纯，上海国光试剂有限责任公司；超纯水 美国Millipore公司超纯水器。

表1 5种农药的理化性质、施用剂量及最大残留限量Table 1 Physicochemical properties,dose ratesof application and MRL of five pesticides

AB SCIEX 4500 QTRAP液相色谱-串联质谱仪配ESI源 美国AB Sciex公司；Elix5超纯水系统 美国Millipore公司；SK-1快速混匀器 浙江省金坛市科析仪器有限公司；移液枪 德国eppendorf公司；T18-B-S25匀浆仪 德国IKA公司；TP-402天平 美国Denver公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 分别称取一定量的5种农药制剂于20 L超纯水中，配制成50 mg/L的混合溶液。称取10.0 kg辣椒样品置于该混合溶液中浸泡30 min后捞出、滤干，于通风处静置24 h，即为沉积农药后的样品P0，用于试验。

1.2.1.1 水洗（P1） 取沉积农药后的辣椒样品，在水流速为5.0 L/min的状态下冲洗5 min，或者在清水中浸泡水洗5 min后滤干水，取300 g样品（3份，100 g/份）粉碎备用。

1.2.1.2 晾干（P2） 分别取经水洗后的辣椒样品置于阴凉处吹干水气，之后从中取300 g样品（3份，100 g/份）粉碎备用。

1.2.1.3 切碎（P3） 分别取经水洗、晾干后的辣椒样品用干净的刀具、砧板将辣椒切碎，取300 g样品（3份，100 g/份）备用。

1.2.1.4 加盐腌制（P4） 分别取经水洗、晾干、切碎后的9.0 kg辣椒样品，加入0.9 kg食盐，充分搅匀，放置5 min，待辣椒腌出汁来，取300 g样品备用，再分装于3个密封坛子中腌制，分别在腌制后的2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和21 d取300 g样品（3份，100 g/份）备用。

1.2.2 样品的提取、净化与检测 参照文献中的QuEChERS方法[23]，并进行改进后，进行提取和净化。称取均质的辣椒样品5.00 g（精确至0.1g）于50 mL塑料离心管中，再加入10.0 mL含1%（v/v）乙酸的乙腈溶液、600.0 mg无水MgSO4和1.0 g氯化钠，振荡提取10 min后在5000 r/min下离心5 min，取出乙腈层于100 mL鸡心瓶中，再加10 mL乙腈重复提取1次，均质离心后合并乙腈层，将提取液于40℃水浴旋转蒸发至约0.5 mL。少量多次加入乙腈涡旋溶解并定容至10.0 mL，取5.0 mL于预先加入200.0 mg C18填料的离心管中，涡旋提取15 s，在5000 r/min下离心5 min，取上层提取液1.0 mL，过0.45μm有机相滤膜后，上机分析测定。

1.2.3 标准储备液和工作溶液的配制 农药标准储备液（100.0μg/mL）的配制：取适量的农药标准物质，用乙腈稀释成100.0μg/mL的储备液，于−20℃冰箱避光保存。准确吸取一定体积的各农药标准储备液，用乙腈定容，得到5种农药1.0μg/mL的标准中间液，于−20℃冰箱避光保存。基质标准液的配制：称取5.0 g空白辣椒样品共7份，进行样品1.2.2的前处理过程后，由此获得空白基质溶液。准确吸取一定量的各农药标准中间液或标准储备液于1.0 mL容量瓶中，用空白基质液定容，配制成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/L系列标准溶液，现配现用，以峰面积(y)和质量浓度(x)作标准工作曲线，采取外标法定量。

1.2.4 检测条件 色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18反相色谱柱（3.0 mm×100 mm，1.8μm），流动相A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈，流速0.4 mL/min，柱温30℃，进样量1.0μL。流动相梯度洗脱条件：0～0.8 min，90%A；0.8～2.8 min，90%A～50%A；2.8～4.8 min，50%A～10%A；4.8～6.8 min，10%A；6.8～7.8 min，10%A～90%A；7.8～10.0 min，90%A。

质谱条件：离子化电压5.5 k V，离子源温度500℃，气帘气压力40 psi，喷雾气压力45 psi，5种农药均采用液相色谱-三重四极杆质谱多反应监测模式测定，具体参数分别见表2。

表2 5种农药的LC-MS/MS分析参数Table2 Experimental parametersand LC-MS/MSconditionsof the pesticidesstudied.

1.3 数据处理

采用Excel表格进行数据统计和作图，利用SPSS软件对数据进行统计分析，两个处理数据采用t检验进行比较，两个以上处理数据采用两因素方差分析（Two-way ANOVA）进行比较，P值<0.05视为不同处理具有显著性差异的判定标准。

加工因子PF（processing factor）是指产品中农药残留量与原料中的农药残留量比值[24]，本研究用加工因子来衡量剁辣椒不同加工工序处理后农药残留量的变化情况，其计算公式如下：

式中：c0表示加工前样品中农药含量平均值；c表示经过加工处理后样品中农药含量平均值。单位均以mg/kg计。

农药暴露风险评估计算：

其中IEDI（International Estimated Daily Intake）为国际日摄入估计（mg/kg bw），STMRi（Supervised Trials Median Residue）、Ei、Pi和Fi分别指农药残留的中位数水平、食品可食部分因子、食品的加工因子和膳食消费量[25]。为了简化评估过程，中位数STMRi采用初始样品中的测定值（mg/kg），Ei=1，Pi为试验的加工因子，Fi为引用汪晓银等的数据，计算我国城市人口每天蔬菜的平均消费量为335 g[26]；ADI为每千克体重的农药日允许摄入量（mg/kg），bw为我国人均体重，一般按60 kg计算。

2 结果与分析

2.1 分散固相萃取条件优化

常用的分散固相萃取的净化吸附剂主要有选择离子交换吸附剂（primary secondary amine，PSA）、惰性吸附剂（C18）和石墨化炭黑，研究发现石墨化炭黑吸附剂能去除食品基质中的色素和甾醇的影响，但本研究中发现石墨化炭黑对精甲霜灵和嘧菌酯的吸附作用较大，添加回收率较低（43.2%～56.7%），不宜采用；故选用对多糖、肽类（包括氨基酸）和色素有强吸附作用的PSA和对色素和油脂等弱极性杂质有较强保留作用的C18作为固相萃取剂进行净化处理[27]。本实验比较了40 mg/mL PSA、80 mg/mL PSA、40 mg/mL C18和80 mg/mL C18四组净化剂对空白基质中添加水平为0.1 mg/kg的5种农药净化效率的影响，结果表明，在1.0 mL待净化液中添加80 mg净化剂后5种农药的回收率较添加40 mg净化剂低，而添加40 mg PSA和40 mg C18对5种农药的回收率没有显著差异（5种农药回收率平均值分别为91.4%和92.3%），但C18净化得到的色谱峰基质影响更小，净化效果要优于PSA，因此选择C18作为本试验的固相萃取材料。

2.2 色谱分析方法确证结果

吡虫啉、啶虫脒、嘧菌酯、精甲霜灵和苯醚甲环唑标准系列溶液按照1.2.4节LC-MS/MS方法进行分析，每个基质标曲浓度进样3次，以质量浓度为x轴，峰面积为y轴，绘制标准曲线，得到上述5种化合物的线性回归方程及相关系数，结果见表3。结果显示，上述5 种化合物的线性回归系数R2在0.99699～0.99950之间，能满足定量分析要求。

以0.01、0.1和1.0 mg/kg 3个水平添加混合标准液到空白辣椒样品中，然后按1.2.2节方法对样品进行分析，每个添加水平做10次平行，计算辣椒中各农药的回收率及变异系数，结果见表3。结果显示，辣椒中5种农药的平均回收率在85.4%～100.4%之间，相对标准偏差在1.5%～8.3%之间。表明本方法的准确度和精密度均符合农药残留分析要求[28]，能够满足实际样品的残留检测分析，空白基质A、基质标准溶液B和加药剁辣椒样品C中5种农药的总离子色谱图见图2。

图2 5种农药的总离子色谱图（TIC）Fig.2 Total ion chromatogram (TIC)of 5 pesticides

表3 辣椒中5种农药的线性回归系数、加标回收率及其相对标准偏差Table3 Regression coefficients(R2),recovery and relative standard deviation (RSD)in linearity conditionsfor the pesticides studied in lettuce

2.3 剁辣椒的水洗方式和水洗时间对农药残留的影响

吡虫啉、啶虫脒、精甲霜灵、嘧菌酯和苯醚甲环唑5种农药的log Kow值在0.57～4.36之间，从表4可以看出，冲洗处理方式较浸泡水洗方式对5种农药的去除效果均较好，不同农药在水洗过程中，农药的log Kow值越大，水洗处理对该农药的去除效果越差，且随着加工时间的增加PF的变化幅度越小。苯醚甲环唑的logKow值为4.36，随时间的增加，PF值虽有减小的趋势，但减小的幅度较小，而吡虫啉和啶虫脒的log Kow值均小于1，随时间的增加PF值减小程度较大，在冲洗10 min后，吡虫啉和啶虫脒的PF值可分别达到0.54和0.59。从浸泡和冲洗方式对5种农药的去除效果看，吡虫啉的去除效果最为明显，而苯醚甲环唑的去除效果最差，且冲洗方式较浸泡方式对农药的去除效果明显。

表4 剁辣椒不同水洗方式和不同时间对5种农药的加工因子Table 4 Processing factors of five pesticide residues with different treatments in chopped pepper

2.4 剁辣椒的加工过程对农药残留的影响

剁辣椒在未加工和不同阶段加工过程中农药残留水平见图3。结果表明，在农药沉积实验中，在用药剂量相同的情况下，5种农药在辣椒中的初始沉积量具有较大差异，特别是苯醚甲环唑的初始沉积量远远大于其他4种农药，说明不同药剂在辣椒中的残留水平有差异，这可能与苯醚甲环唑的高log Kow值和高渗透性等有关。初剁辣椒不同加工阶段对所有农药的影响有相似之处，5种农药残留在经过整个剁辣椒加工工序后的农药残留均有大幅下降，且在用水冲洗时均出现明显下降，不同洗涤方式（包括水浸泡5 min和水冲洗5 min）去除的农药残留有差别，且用水冲洗去除农药残留效果更好。不同清洗方式对豇豆种农药残留的影响研究中也发现，冲洗和振动清洗较浸泡清洗对农药残留的清除效果好[8]。而不同农药的降解率的差异可能与农药的理化特性有关，因为农药的log Kow值越高越容易进入农产品表面的蜡质层，清洗时不易溶解在清洗液中而被去除，故很难降低农产品上这些农药的残留量[29]。

图3 剁辣椒加工过程中的农药残留水平Fig.3 Pesticide residues in chopped pepper during processing

剁辣椒水洗后的晾干和切碎过程对5种农药残留的去除作用不明显，表5结果表明，晾晒过程5种农药的加工因子在0.91～1.03之间，而切碎过程5种农药的加工因子在0.88～0.99之间。加盐腌制过程对5种农药的残留影响有差异，log Kow值小于2的吡虫啉、啶虫脒和精甲霜灵三种农药，加盐腌制2 h的加工因子分别为0.91、1.00、0.96；而logKow值大于2的嘧菌酯和苯醚甲环唑，加盐腌制2 h的加工因子分别为0.71和0.47，说明农药的log Kow值越大，加盐腌制处理对该农药的去除效果越好，这与水洗过程中的加工因子关系相反。黄瓜加工过程对农药加工因子影响也有类似现象，吡虫啉（log Kow值=0.57）加盐腌制2 h的加工因子为0.91，而氯氰菊酯（log Kow值=6.30）加盐腌制2 h加工因子为0.68[30]。这些规律为降低log Kow值较高农药的残留量提供了一种加工处理方式的新思路。

表5 剁辣椒不同加工阶段对5种农药的加工因子Table 5 Processing factors of five pesticide residues with different treatmentsin chopped pepper

随着剁辣椒腌制时间的增加，在腌制0～7 d农药的残留量下降较快，但7 d后残留量下降很缓慢，特别是14 d后5种农药的加工因子均大于0.85，说明在剁辣椒腌制后期这5种农药的降解速率变慢了。剁辣椒在加盐腌制后是一种由有氧环境逐渐变为无氧环境的过程，剁辣椒中的好氧微生物逐渐被厌氧乳酸菌所代替，而这可能是在腌制后期剁辣椒中农药降解速率变慢的原因。

尽管剁辣椒整个加工过程中5种农药在不同加工阶段的加工因子有所不同，但从整个加工过程分析发现，加工全过程对5种农药的残留去除效果均比较明显，剁辣椒加工全过程（至腌制21 d止），吡虫啉、啶虫脒、精甲霜灵、嘧菌酯和苯醚甲环唑的全过程加工因子分别为0.20、0.32、0.23、0.21和0.14。

2.5 加工方式对消费者的农药暴露风险的影响

在风险评估中一般用农药残留摄入的最大理论日摄入估计（Theoretical Maximum Daily Intake，TMDI）评估农药的暴露风险，但由于以MRL为农药残留水平，往往高于实际残留水平，所以造成过高估计。所以一般用国际日摄入估计（International Estimated Daily Intake，IEDI）作为TMDI的评估校正，农药残留的风险指数越低，说明摄入膳食越安全。根据试验数据和公式，计算剁辣椒加工对食用剁辣椒的风险指数的影响。从表6可以看出，经过剁辣椒家常腌制21 d后5种农药的农药残留的膳食暴露量大大降低，膳食风险指数分别较未加工降低了80.6%、68.7%、76.3%、78.4%、85.9%。

表6 试验农药的膳食暴露风险指数Table6 Risk index of dietary exposure for tested pesticide

3 结论

综上所述，吡虫啉、啶虫脒、精甲霜灵、嘧菌酯和苯醚甲环唑的全过程加工随着加工时间的增加农药残留量呈降低的趋势，全过程加工因子分别为0.20、0.32、0.23、0.21和0.14。而5种农药在剁辣椒加工不同加工阶段的加工因子规律有所不同，吡虫啉、啶虫脒和精甲霜灵的水洗PF值在整个加工过程中最小，而嘧菌酯和苯醚甲环唑的加盐腌制PF值在整个加工过程中最小。本研究发现引起剁辣椒不同加工阶段对农药残留影响的差异可能与农药本身的理化特性密不可分，log Kow（辛醇水分配系数）值小的农药，在水洗处理下的残留量少，且冲洗处理较浸泡处理去除农药效果好；而log Kow值大的农药，在加盐腌制处理下的残留量少，且在剁辣椒腌制的无氧环境中农药降解速率逐渐变缓。

剁辣椒加工过程可减少农药残留的膳食风险指数，通过将辣椒产品加工成剁辣椒的方法来降低辣椒中的农药残留，减少其膳食摄入量。试验结果表明，经过家常剁辣椒加工腌制21 d后5种农药的膳食风险指数分别较未加工降低了80.6%、68.7%、76.3%、78.4%、85.9%。因此希望有关部门应结合农产品加工工艺和农药的理化特性合理评估膳食中的农药暴露水平，同时希望通过不断优化农产品加工工艺以减少农产品中的农药残留，保障农产品质量安全。