克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵培养基的优化

韦祥银

（润盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）属于革兰氏阳性细菌，可产生芽孢，属于嗜碱杆状细菌，产过氧化氢酶和氧化酶，可降解明胶和淀粉、还原硝酸盐。克劳氏芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶在清洁剂、丝绸脱胶、皮革工业、食品工业、制药行业、摄影行业及生活垃圾处理等领域有重要的应用价值[1-3]。克劳氏芽孢杆菌作为碱性蛋白酶天然分泌的优势菌株之一，有着重要的应用前景及价值[4-5]。

克劳氏芽孢杆菌除了产碱性蛋白酶，还具有益生菌功能，其产生的芽孢具有很强的抗逆性，具有耐酸、耐碱和耐胆盐特性，可顺利通过人体胃、胆汁，到达肠道后萌发，刺激人体免疫反应，可用于治疗儿童和成人腹泻和便秘问题[6-8]。

本文利用单因素试验、正交试验、最陡爬坡试验和响应面法对克劳氏芽孢杆菌BC-G21 的培养工艺和培养条件进行优化研究，得到克劳氏芽孢杆菌BC-G21 的最佳发酵培养基组成和培养条件，为克劳氏芽孢杆菌发酵研究提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

克劳氏芽孢杆菌BC-G21，润盈生物工程（上海）有限公司研发中心实验室菌种库提供。

芽孢发酵基础培养基：葡萄糖5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠0.5 g/L、磷酸氢二钾0.3 g/L、氯化钙3 g/L、七水硫酸镁0.25 g/L、一水硫酸锰0.05 g/L、pH调至中性。

改良的LB 培养基：蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L、酵母粉5 g/L、pH 调至9.5。

1.2 仪器和设备

HH-W600 数显恒温三用水箱，常州中捷实验仪器制造有限公司；百伦BLBIO15 型发酵罐，上海百伦生物科技有限公司；SKY-2102C 恒温培养振荡器，上海苏坤实业有限公司；DNP-9082 电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；1 mL 和200 μL 移液器，德国Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 种子培养

一级种子：BC-G21 甘油管接入改良LB 液体培养基中，置于37 ℃振荡培养箱中，培养24 h。

二级种子：将活化后的菌种按体积比2%接种到装有50 mL 改良的LB 液体培养基的250 mL 三角瓶中，置于37 ℃振荡培养箱中，培养24 h。

1.3.2 三角瓶发酵及芽孢活菌数计数

上述二级种子按2%体积分数接种至装有200 mL液体LB 改良培养基的250 mL 三角瓶中，置于37 ℃振荡培养箱中，培养36 h。发酵培养液利用连续梯度稀释方法进行稀释，计数试管于80 ℃水浴10 min 后迅速冷却，加至提前倒置好的改良LB 固体培养基上进行涂布计数。

1.3.3 培养基优化

以芽孢发酵基础培养基作为起始培养基，选择添加量为5 g/L 的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糊精、玉米淀粉、小麦淀粉以及糖蜜单一碳源作为碳源，进行碳源优化实验；选择添加量为10 g/L 蛋白胨（骨蛋白胨）、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸膏、酵母粉、鱼蛋白胨、硫酸铵、脱盐乳清粉、酪蛋白胨以及乳清粉进行单一氮源优化实验；进行三角瓶实验，置于37 ℃振荡培养箱中，培养36 h，进行发酵液芽孢有效活菌计数，初步确定培养基成分。

在上述优化后的培养基基础上，添加10 g/L 的大豆蛋白、小麦蛋白、土豆蛋白、花生蛋白、豌豆蛋白、棉籽饼粉、玉米浆粉、玉米浆液以及豆粕粉的粗料，进行三角瓶试验，置于37 ℃振荡培养箱中，培养36 h，进行发酵液芽孢有效活菌计数，初步确定培养基成分。

1.3.4 发酵培养基组分比例优化

针对上述优化结果，选择效果最好的碳源、氮源和粗料3 种因素进行最陡爬坡试验、中心组合设计（Central Composite Design，CCD）、响应面拟合优化分析，得到最适合添加量。

1.3.5 三角瓶培养条件优化

对初始pH、接种量和培养温度3 因素进行优化设计试验，确定克劳氏芽孢杆菌BC-G21 较优的三角瓶培养条件。

1.3.6 发酵罐方法验证

摇瓶发酵培养基配方和培养条件优化确定后，进行10 L 的小试发酵放大试验，接种装有10 L 培养基的15 L罐中，恒温37 ℃、搅拌180 r/min、通气1.2 m3/h、添加0.2%消泡剂，培养36 h，取样检测发酵液芽孢有效活菌数，验证优化后的培养基配方及培养条件。

1.2 数据处理

所有发酵培养基摇瓶试验均重复3 次，10 L 罐试验共重复6 次，数据结果取平均数。试验数据利用WPS-2016 软件进行数据汇总分析。发酵培养基主要成分比例响应面预测分析、方差分析利用Design Expert 8.0 软件进行分析预测。

2 结果与分析

2.1 培养基优化结果

2.1.1 碳源优化结果

碳源为微生物生长提供重要的能源和目的产物合成所需的碳成分，最终影响发酵活菌数和目的产物的产量。多种碳源组合有利于菌体和芽孢的均衡生长，但过高的碳源亦不利于芽孢杆菌的芽孢形成。不同碳源对克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数的影响如图1 所示，由图1 可知，在原先芽孢基础培养基上分别添加5 g/L 的葡萄糖、玉米淀粉和麦芽糊精为碳源时，克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数较高，因此以三者为考察因素进行正交实验，结果见表1。

图1 不同碳源对克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数的影响

由表1 可知，碳源正交实验的极差值葡萄糖＞玉米淀粉＞麦芽糊精，最优组合为葡萄糖15 g/L、玉米淀粉40 g/L 和麦芽糊精16 g/L。按照此优化组合进行碳源添加，克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢有效活菌数最高可达9.1×108CFU/mL。

表1 克劳氏芽孢杆菌BC-G21 碳源优化正交实验

2.1.2 氮源优化结果

氮源可提供菌体生长所需的蛋白质、调节发酵过程中pH，同时还提供无机盐和生长因子。氮源分为有机氮源和无机氮源，无机氮源菌体利用速度快，发酵利用周期较短。有机氮源利用速度较慢，时效周期较长，有利于芽孢杆菌发酵芽孢的形成，但来源相对不稳定，成分复杂。所以可利用多种氮源进行组合，减少原料带来的影响。不同氮源（10 g/L）对克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数的影响如图2所示，由图2 可知，在优化好的芽孢基础培养基上分别添加10 g/L 的蛋白胨、大豆蛋白胨和酵母粉为氮源时，克劳氏芽孢杆菌BC-G21发酵液芽孢活菌数较高，以三者为考察因素做正交实验，结果见表2。

图2 不同氮源对克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数的影响

由表2 可知，氮源正交实验的极差值蛋白胨＞大豆蛋白胨＞酵母粉，最优组合为蛋白胨10 g/L、大豆蛋白胨30 g/L 和酵母粉5 g/L。按照此优化组合进行氮源添加，克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢有效活菌数最高可达1.15 ×109CFU/mL。

表2 克劳氏芽孢杆菌BC-G21 氮源优化正交实验

2.1.3 粗料优化结果

不同植物原料（如大豆、玉米、小米、豌豆和土豆等）、不同水解程度的蛋白粉或浆液体等粗料，发酵时沉降较多、成分复杂、营养丰富、各种固体介质对芽孢杆菌后期芽孢的形成有较好作用，缩短发酵后期[9-10]。不同的粗料组合有利于营养平衡，减少原料来源不稳定因素给发酵带来的影响。不同粗料对克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数的影响如图3 所示，由图3 可知，在优化好的芽孢基础培养基上分别添加10 g/L 的小麦蛋白、土豆蛋白和大豆蛋白为粗料时，克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数较高，以三者为考察因素做正交实验。

图3 不同粗料对克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数的影响

由表3 可知，粗料正交实验的极差值土豆蛋白＞小麦蛋白＞大豆蛋白，最优组合为土豆蛋白10 g/L、小麦蛋白15 g/L 和大豆蛋白15 g/L。按照此优化组合进行粗料添加，克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢有效活菌数最高可达1.48×109CFU/mL。

表3 克劳氏芽孢杆菌BC-G21 粗料优化正交实验

2.2 响应面效应法优化克劳氏芽孢杆菌BC-G21 主影响成分的比例

基于2.1 试验确定葡萄糖、蛋白胨和土豆蛋白为3 个最显著因素，据此进行最陡爬坡试验，确定中心点。

由表4 结果可知，随着3 个显著因素（葡萄糖、蛋白胨和土豆蛋白）的添加量增加，克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数先上升后下降，在葡萄糖添加量15 g/L、蛋白胨添加量11 g/L 和土豆蛋白添加量为13 g/L 时（第5 组），克劳氏芽孢杆菌BC-G21发酵液芽孢活菌数达到最大。基于第5 组3 个显著因素的添加量为中心点，以葡萄糖添加量（A）、蛋白胨添加量（B）和土豆蛋白添加量（C）为自变量，以克劳氏芽孢杆菌BC-G21 芽孢有效活菌数为响应值（Y），利用DX-8.0 软件设计3 因素5 水平的中心组合设计（Central Composite Design，CCD），数据结果如表5 和表6 所示。

表4 BC-G21 培养基成分最陡爬坡试验设计及结果

表5 克劳氏芽孢杆菌BC-G21 培养基成分CDD 设计及结果

利用DE-8.0 软件进行结果分析，模型拟合方程为Y=17.35-1.14A+0.93B-0.39C-0.31AB-0.24AC-0.24BC-2.84A2-2.34B2-1.56C2。得到的模型的决定系数是R2为0.998 8，RAdj=0.997 8，RPre=0.995 9，预测度较高。由表6 可知，模型P值＜0.0001，说明此模型对于响应值Y影响极显著，可信度较高。模型的失拟项P值为0.765 7 ＞0.05，影响不显著，说明此回归模型可信，可较好的解释和预测克劳氏芽孢杆菌BC-G21 的芽孢有效活菌数。

表6 BC-G21 培养基成分响应面结果方差分析

根据拟合方程绘制出响应面三维图见图4。由图4 可知，土豆蛋白与葡萄糖、葡萄糖与蛋白胨、土豆蛋白与蛋白胨对克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢有效活菌数的交互作用显著（P＜0.01）；在一定范围内，随着土豆蛋白、葡萄糖和蛋白胨浓度的增加，克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数随之增加；当达到最大值后，发酵液芽孢活菌数逐渐下降，进一步说明了3 个因素之间存在交互作用共同影响着克劳氏芽孢杆菌的芽孢数量，只有各因素在合适的添加量时，发酵液的芽孢数量才会达到最大值。

图4 各因素交互作用对芽孢有效活菌数影响的响应面和等高线

利用响应面优化得到克劳氏芽孢杆菌BC-G21的最佳添加量为葡萄糖14.59 g/L、蛋白胨11.44 g/L和土豆蛋白12.75 g/L，其余的培养基按照优化后的量添加。该模型预测的最大值为1.759×109CFU/mL。按照上述优化后的培养基量添加，37 ℃振荡培养箱中培养36 h 后，发酵液芽孢活菌数为1.76×109CFU/mL，可见该模型可较好地预测克劳氏芽孢杆菌BC-G21的发酵芽孢活菌数。

2.3 三角瓶培养条件优化结果

由表7 可知，此试验的培养基发酵条件中3 个主要影响因素的影响顺序为起始pH ＞接种量＞培养温度，最优条件为起始pH 为10.0、接种量为2%、培养温度为37 ℃，在此培养条件下克劳氏芽孢杆菌BC-G21 发酵液芽孢活菌数为1.93×109CFU/mL。

表7 BC-G21 三角瓶培养条件优化设计及结果

2.4 10 L 发酵罐发酵试验结果

上述摇瓶发酵培养基配方和培养条件优化后，进行10 L的小试发酵放大试验，接种装有10 L培养基的15 L 罐中，恒温37 ℃、搅拌180 r/min、通气1.2 m3/h、添加0.2% 消泡剂，培养36 h，取样检测发酵液芽孢有效活菌数，测得发酵液芽孢有效活菌数为3.88×109CFU/mL，较本实验室培养芽孢基础培养基10 L 发酵结果（4.0×108CFU/mL）提高了约10 倍。

3 结论

细菌孢子形成剂具有热稳定性好、生存能力强和通过胃屏障存活率高的特点，利用这些特性可将其用作人类饮食和动物饲料中的益生菌补充剂[11-12]。就全球范围来看，克劳氏芽孢杆菌（Bacillus calusii）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、蜡状芽孢杆杆菌（Bacillus cereus）一样，可单独或与其他益生菌组合使用，作为儿童和成人治疗腹泻和便秘的芽孢类益生菌[13-15]。本试验采用正交设计、中心组合设计和响应面分析相结合的方法，确定了最显著因子的最佳添加量，为克劳氏芽孢杆菌高质量、高密度发酵培养芽孢提供一定参考依据。

克劳氏芽孢杆菌BC-G21 高密度培养过程中最优培养基为葡萄糖14.59 g/L、玉米淀粉40 g/L、麦芽糊精16 g/L、蛋白胨11.44 g/L、大豆蛋白胨30 g/L、酵母粉5 g/L、土豆蛋白12.75 g/L 、小麦蛋白15 g/L、大豆蛋白15 g/L、氯化钠0.5 g/L、磷酸氢二钾 0.3 g/L、氯化钙3 g/L、七水硫酸镁0.25 g/L、一水硫酸锰0.05 g/L；最佳培养条件为接种量2%，起始pH 10.0，恒温37 ℃；利用10 L 发酵罐验证发酵，采用优化后的发酵培养基和发酵条件进行培养，克劳氏芽孢杆菌BC-G21的芽孢有效活菌数达到了3.88×109CFU/mL，较本实验室芽孢基础培养基10 L 发酵芽孢活菌数4.0×108CFU/mL 提高了约10 倍。合理的培养基及合适的培养条件使发酵培养基发酵营养更加均衡、营养更加丰富、发酵结果更加稳定，有利于规模化稳定性生产。