猪链球菌纳米PCR检测方法的建立和应用

张昆丽，林本夫，席振军，杨冬霞，卞志标，宋 帅，蒋智勇，蔡汝健，李春玲

(1.广东省农业科学院 动物卫生研究所，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东 广州 510640；2.广州市花都区动物卫生监督所，广东 广州 510800)

猪链球菌病属于国家规定的二类动物疫病，是由猪链球菌(Streptococcussuis，SS)感染引起的人畜共患传染病。该病以急性败血症、关节炎、脑膜炎和急性死亡为主要特征，各年龄段的猪均可发病，且对低日龄仔猪危害尤为严重，临床上猪链球菌常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染或继发感染，导致猪群发病率和死亡率明显上升，严重制约我国乃至世界生猪养殖业的健康发展[1]。感染猪链球菌的病猪及其相关制品具有传染性，主要感染养殖业和食品加工从业者，引起脑膜炎、心内膜炎、中毒性休克，甚至死亡，死亡率可达17.8%，给全球公共卫生安全带来巨大隐患[2-3]。快速高效的早期诊断对传染性疾病的控制与治疗具有重要作用，因此，开展猪链球菌新型检测技术的研究，丰富猪链球菌检测技术平台，对防止猪链球菌的传播与流行，保障我国生猪养殖业的发展及从业人员的健康具有重要意义。

根据菌体荚膜的抗原特性，目前，猪链球菌共有35个血清型(1～34型和1/2型)，其中2型(SS2)分布范围最广、毒力最强，对猪的致死率最高，血清1、7和9型也是目前临床上较常见的致病血清型，猪链球菌往往多种血清型混合感染或先后感染[4]。猪链球菌的检测方法包括病原学诊断和血清学诊断，其中病原学诊断主要以细菌分离鉴定、普通PCR、荧光定量PCR等分子生物学手段为主。细菌分离鉴定是细菌性传染病诊断的金标准，但该过程繁琐费时费力，加之临床多病原混合感染严重，样品采集和保存不当常常导致病原菌分离失败。猪链球菌的血清学诊断方法主要有凝集试验、ELISA、胶体金免疫层析方法、荧光检测方法等，这类方法简便快速，但与分子生物学检测方法相比，灵敏度相对较低，假阳性较多[5-7]。猪链球菌的主要毒力因子谷氨酸脱氢酶 (Glutamate dehydrogenase，GDH)，具有良好的免疫原性，且编码基因保守性较好，常作为猪链球菌分子生物学检测的靶标基因[8]。目前，已建立多种关于猪链球菌的PCR检测方法，其中普通PCR具有经济、高效的特点，使用频率较高，但该方法检测敏感性相对较低，无法适应微量检测需求，荧光定量PCR检测灵敏度比普通PCR高10倍以上，但仪器设备及试剂耗材昂贵，基层推广应用较难[9]。近年来，随着材料学的高速发展，研究发现纳米材料除了在药物、疫苗等生命领域具有重要作用，也适用于检测试剂盒开发，如纳米PCR技术。纳米PCR技术是纳米材料学与现代分子生物学相结合的新型技术，通过在PCR反应体系中添加一定量的纳米金属颗粒，利用其加强启动DNA聚合酶、调节DNA聚合酶活性、增强体系导热性能等特点，缩短反应时间，促进特异性产物的扩增，提高PCR检测方法的灵敏度[10]。目前，该新型检测技术已逐步应用到非洲猪瘟、猪流行性乙型脑炎、禽传染性关节炎及犬细小病毒感染等动物疫病的检测中，但该技术在细菌性疫病中的应用鲜见报道[11-14]。因此，本研究旨在针对SS感染，试图寻求一种更高效、更快捷的检测方法，通过加入纳米颗粒建立猪链球菌纳米PCR检测技术，为我国猪链球菌的基层防控及检验检疫提供技术储备。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)为OXOID公司产品，新生犊牛血清为四季青生物制品有限公司产品，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为南京生兴生物技术有限公司产品。细菌DNA提取试剂盒为大连宝生物科技有限公司产品，2×PCR Buffer、Taq酶、DL2000 DNA Marker等为南京诺唯赞生物科技有限公司产品，纳米PCR试剂盒为上海沪峥生物科技有限公司产品。

1.2 菌株

血清1、2、7和9型的猪链球菌(SS)、血清7型的猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、血清5型的副猪嗜血杆菌(H.parasuis)、猪大肠杆菌(swineE.coli)、猪沙门氏菌(S.suis)、猪葡萄球菌(S.hyicus)由广东省农业科学院动物卫生研究所猪病研究室提供。

1.3 细菌培养与基因组DNA提取

用TSB培养基(含10%犊牛血清，30 mg/L NAD)37 ℃ 220 r/min分别培养1.2的菌株12 h，12 000 r/min离心5 min获得细菌团块。按照1.1中的细菌DNA提取试剂盒说明书，抽提不同细菌的DNA，经紫外线分光光度计测定浓度后，保存在-20 ℃备用。

1.4 猪链球菌纳米PCR引物设计与合成

以猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因(gdh)为模板，用Primer 5.0软件设计特异性引物，SS-F：5′-CATGGACAGATAAAGATGGA-3′，SS-R：5′-CAGCGTATTCTGTCAAACGA-3′，目的片段大小为687 bp，经生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，用ddH2O将引物稀释至10 pmol/μL，保存在-20 ℃备用。

1.5 猪链球菌纳米PCR反应体系优化

以猪链球菌的DNA为模板，PCR扩增SS的gdh基因。纳米PCR反应体系与普通PCR反应体系均预设定为16.0 μL：10 pmol/μL的上、下游引物各1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL、MgCl2(25 mmol/L)1 μL、PCRTaq酶(5 U/μL)0.2 μL、DNA(50 ng/μL)1 μL、 ddH2O 补齐，纳米PCR使用2×Nano PCR Buffer，普通PCR反应使用2×PCR Buffer，均各加8 μL。扩增程序为：94 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶分离，并用天能凝胶成像系统拍照。

利用梯度PCR仪依次优化退火温度和引物浓度，根据琼脂糖核酸电泳结果，判定最佳的退火温度和引物浓度，明确纳米PCR反应体系。设定梯度PCR仪的退火温度为51～60 ℃，按照预设反应体系加样后，进行PCR反应，确定最佳退火温度；保持细菌DNA及其他组分用量不变，依次增加引物浓度，引物使用量从0.6 μL开始，以0.1 μL递增至1.9 μL，按照已确定的退火温度进行PCR反应，明确最佳引物浓度。

1.6 猪链球菌纳米PCR特异性试验

以临床常见的几种主要的猪细菌性病原，SS(2型)、APP(7型)、H.parasuis(5型)、swineE.coli、S.suis、S.hyicus的DNA为模板，按已优化的纳米PCR反应条件进行PCR扩增，判定该方法对猪链球菌的特异性。同时，提取猪链球菌在我国流行的其他主要致病血清型菌株，1(SS-1型)、7(SS-7型)和9型(SS-9)的基因组DNA，并用该方法进行检测，判定本研究建立的纳米PCR方法对猪链球菌不同血清型菌株的特异性。

1.7 猪链球菌纳米PCR敏感性试验

取培养过夜的SS菌液，通过倍比稀释后进行平板计数，根据菌液浓度，将细菌调整至1×109cfu/mL，然后10倍浓度梯度稀释至1×10 cfu/mL，按照1.5已优化的反应体系分别进行纳米PCR、普通PCR扩增。PCR产物经琼脂糖核酸电泳后，比较纳米PCR和普通PCR对SS检测敏感度，重复3次试验。

1.8 猪链球菌纳米PCR重复性试验

提取猪链球菌(1×106cfu/mL)基因组DNA，并将其稀释10，100倍，以上述3个梯度的DNA作为模板，每个浓度梯度设3个重复，进行重复性试验。

1.9 猪链球菌临床样品检测

提取疑似猪链球菌感染的44份临床样品的DNA，分别用普通PCR及本研究建立的纳米PCR方法进行样品检测，并统计阳性率。

2 结果与分析

2.1 猪链球菌纳米PCR反应体系及条件的优化

依次优化退火温度(图1)和引物浓度(图2)后，猪链球菌纳米PCR的反应体系如下：上、下游引物(10 pmol/μL)各1.1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL、MgCl2(25 mmol/L)1 μL、Taq酶(5 U/μL)0.2 μL、DNA(50 ng/μL)1 μL、2×Nano PCR Buffer 8.0 μL、ddH2O补足16.0 μL。扩增程序为：94 ℃ 30 s，53 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，循环35个反应。

M.DNA分子质量标准DL2000；1-10.51～60 ℃；11.H2O。M.DL2000 DNA Marker；1-10.51-60 ℃；11.H2O.

M.DNA分子质量标准DL2000；1-14.0.6～1.9 μL；15.H2O。M.DL2000 DNA Marker；1-14.0.6-1.9 μL；15.H2O.

2.2 猪链球菌纳米PCR特异性试验

以SS(2型)、APP(7型)、H.parasuis(5型)、swineE.coli、S.suis、S.hyicus的DNA为模板，同时以H2O作为阴性对照，按照1.5已优化的纳米PCR反应条件扩增。经电泳检测表明，仅有SS(2型)的DNA样品扩增得到687 bp的DNA片段，其余细菌样品的PCR结果均为阴性，说明本研究建立的猪链球菌纳米PCR方法与其他细菌无交叉反应，具有良好的种属特异性(图3)。然后，用该方法检测我国流行的猪链球菌其他主要致病血清型菌株1(SS-1型)、7(SS-7型)和9型(SS-9)的基因组DNA，同时设立阴性对照，结果显示，该方法能同时识别1、2、7和9型的猪链球菌(图4)。综上，表明该方法特异性良好。

M.DNA分子质量标准DL2000；1.猪链球菌(2型)；2.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌；3.副猪嗜血杆菌；4.猪大肠杆菌；5.猪沙门氏菌；6.猪葡萄球菌；7.H2O。

2.3 猪链球菌纳米PCR敏感性试验

先用TSB液体培养基培养猪链球菌12 h，经平板计数法测定猪链球菌菌落总数后，将细菌的浓度调整至1×109cfu/mL，用灭菌水将链球菌按10倍浓度梯度依次稀释至10 cfu/mL，进行纳米PCR及普通PCR扩增。反应结束后进行琼脂糖凝胶核酸电泳。结果如下图所示，纳米PCR和普通PCR对猪链球菌的检测下限分别为10，103cfu/mL，表明本研究建立的猪链球菌纳米PCR灵敏度显著增加，其敏感性比普通PCR提高了100倍(图5)。

M.DNA分子质量标准DL2000；1. 猪链球菌-1型；2.猪链球菌-2型；3.猪链球菌-7型；4.猪链球菌-9型；5.H2O。

M.DNA分子质量标准DL2000；1-9. 109～10 cfu/mL；10.H2O。M.DL2000 DNA Marker；1-9. 109-10 cfu/mL；10.H2O.

2.4 猪链球菌纳米PCR重复性试验结果

提取猪链球菌(1×106cfu/mL)基因组DNA，并将其进行3个浓度梯度稀释，每个梯度设3个重复，进行重复性试验。结果表明，不同浓度梯度的SS基因组DNA均能有效扩增，说明该方法稳定性好(图6)。

2.5 临床样品检测结果

根据临床症状，收集来自广东不同地区的44份疑似猪链球菌感染的病料，按照1.3的方法提取上述样品中的DNA，分别用猪链球菌的常规PCR方法和本研究建立的纳米PCR方法检测，结果经统计发现猪链球菌普通PCR和纳米PCR方法对该菌的阳性检出率分别为54.5%(24/44)，72.7%(32/44)，且纳米PCR检测出的阳性、阴性样品与普通PCR检测结果100%符合，可见纳米PCR不仅准确度较好，检出率与普通PCR相比提高18.2百分点，显著提高了猪链球菌感染的检验检疫率(表1)。

M.DNA分子质量标准DL2000；1-3. 1×106 cfu/mL；3-6. 1×105 cfu/mL；7-9. 1×104 cfu/mL；10. H2O。M. DL2000 DNA Marker；1-3.1×106 cfu/mL；3-6.1×105 cfu/mL；7-9. 1×104 cfu/mL；10.H2O.

结果Testing results普通PCRRoutine PCR纳米PCRNano PCR阳性总数24/4432/44Total number of positive阳性率/%54.572.7The positive rate阴性总数20/4412/44Total number of negative total阴性率/%45.527.3The negative rate

3 讨论

纳米PCR技术是在PCR反应体系中添加1～100 nm的纳米金属颗粒，形成纳米流体，将PCR技术从均相体系扩展到纳米粒子表面。金属纳米粒子优良的热传导性，提高了PCR反应体系的升温和降温速度，利于模板和引物的高效配对，增加扩增的特异性与反应速率[15]。通过扫描电镜和透射电镜观察发现，纳米材料能够附着于DNA分子和Taq酶表面。研究发现，纳米材料能够和DNA分子进行非共价结合，调节反应体系中DNA的聚合及稳定性，降低模板Tm，进而提升扩增效率；纳米粒子还能与游离的Taq酶进行可逆结合，动态调节Taq酶的更替频率，进一步提高PCR扩增效率[10，16]。纳米材料还能通过电荷效应等极大地提高反应物组分的动力学接触，从而提高PCR反应效率，减少DNA的用量，提高PCR的扩增效率和敏感性[17]。目前，纳米粒子在长片段PCR、反复扩增PCR、实时定量PCR等方面已取得较好应用结果，报道表明，纳米PCR方法比常规PCR方法敏感性可提高10～1 000倍，显著改进了PCR反应的扩增效率与特异性[18]。可见，纳米材料具有传统PCR反应添加剂无法达到的特殊效果，为PCR反应的优化，提供了新思路、新技术。将纳米PCR技术应用于动物疫病研究中，可为动物疫病的早期诊断及控制提供更加高效准确的检测技术平台。目前，该技术在多种动物病毒性疫病的检测中敏感性显著提高，但细菌性动物疫病的检测中鲜少用到该技术。

猪链球菌是猪场中常见的重要细菌性病原，通过昆虫媒介、粪口途径、呼吸道途径，甚至垂直传播，感染不同年龄段的猪，仔猪感染表现为急性败血症和脑脑炎，病程较短死亡率极高，中猪多表现为化脓性淋巴结炎[19]。目前，该病遍布全球，常呈地方性爆发流行，该菌现有35个血清型，其中2型猪链球菌流行范围最广泛，此外，1、7、9型也是较常见的致病性血清型，且2、9型对人具有感染性，世界多地区曾有感染病例报道，可见猪链球菌是重要的人畜共患病病原，具有重要公共卫生安全意义[20]。建立高效的分子诊断手段有利于从源头上监测该病的流行情况，利于早期感染的检测与控制。本研究通过引入纳米金属颗粒，提高PCR反应效率和敏感性，建立了以谷氨酸脱氢酶基因为检测靶标的猪链球菌纳米PCR检测方法。该方法满足临床上多血清型混合感染的检测需求，能同时检测到1、2、7和9型4个主要流行血清型，与其他猪场常见的细菌性病原猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌均无交叉反应，且与传统PCR方法相比，敏感性提高100倍。临床样品检测结果显示，本研究建立的纳米PCR方法大大提升了猪链球病的检出效率，虽然该技术无法区分猪链球菌具体血清型，但该技术能同时检测出目前流行的4个主要致病血清型，且阳性样本的检出率比普通PCR高18.2百分点，可作为猪链球菌感染早期诊断的高效筛查技术。综上，本研究建立的猪链球菌纳米PCR检测方法不仅实用性强，特异好，且检测敏感度更佳，为猪链球菌病的临床诊断和检测提供了新的技术支持。