唑来膦酸对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制
2021-09-02李刚刘明王太鹏
李刚，刘明，王太鹏
作者单位：烟台龙矿中心医院外四科，山东烟台265700
骨肉瘤是儿童癌症病人死亡的最主要原因之一。常用的治疗方案为手术前后辅助化疗，但其生存率仍不足20%。唑来膦酸（ZOL）在癌症中的治疗作用得到普遍认可，但其在骨肉瘤中的作用机制尚未完全清楚。miRNA为一种短链非编码内源性微小RNA，其通过抑制或沉默靶基因转录蛋白过程，而发挥调控癌症发生发展的作用。miR-520a-3p虽在其他癌症中具有抑癌作用，但其在骨肉瘤中与唑来膦酸和T细胞特异性转录因子7（TCF7）的调控机制尚未有人报道。本实验旨在研究唑来膦酸对骨肉瘤细胞HOS增殖、迁移和侵袭以及其对miR-520a-3p、TCF7表达的影响，于2018年6月至2019年1月通过过表达miR-520a-3p、抑制miR-520a-3p对唑来膦酸处理的HOS细胞增殖、迁移和侵袭的影响，揭示其机制与唑来膦酸上调miR-520a-3p，抑制TCF7表达有关，将为唑来膦酸治疗骨肉瘤奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
人骨肉瘤细胞（HOS）购自美国ATCC；唑来膦酸（密固达，批号S0261，5 mg/100 mL）购自北京诺华制药有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、噻唑蓝（MTT）、胰蛋白酶均购自美国Sellect公司；基质胶、Transwell小室购自美国Coming公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；Lipofectamine2000、BCA蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司。1.2 方法
1.2.1
细胞培养以含10%胎牛血清的DMEM培养液培养HOS细胞，环境条件为37℃，5%二氧化碳。1.2.2
细胞转染将ZOL（50 μmol/L）处理48 h的HOS细胞，标记为ZOL组；未做任何处理的HOS细胞，标记为对照组；将miR-con、miR-520a-3p mimics分别转染到HOS细胞48 h，分别标记为miR-con组、miR-520a-3p组；将anti-miR-con、anti-miR-520a-3p分别转染到HOS细胞48 h，再经50 μmol/L ZOL处理48 h，分别标记为ZOL+anti-miR-con组、ZOL+antimiR-520a-3p组；将anti-miR-520a-3p分别与si-con、si-TCF7共 转染 到HOS细 胞48 h，再 经50 μmol/L ZOL处理48 h，分别标记为ZOL+anti-miR-520a-3p+si-con组、ZOL+anti-miR-520a-3p+si-TCF7组。1.2.3
MTT法检测细胞活性取各组细胞，加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），震荡，使结晶溶解，检测490 nm处的吸光度。1.2.4
Transwell实验检测细胞迁移和侵袭加入100 μL（10个/毫升）HOS细胞于Transwell小室上室，600 μL含血清的培养基加入下室，培养过夜。取出小室，棉签擦去上室内细胞，磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤。于显微镜下，随机选5个视野计迁移细胞数。在Transwell小室上表面铺适量厚度的基质胶，按上述操作方法计侵袭细胞数。
1.2.5
实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测细胞中miR-520a-3p的表达提取各组细胞RNA，BCA定量，合成互补DNA（cDNA）后，按qRT-PCR试剂盒说明书检测miR-520a-3p表达，用2计算miR-520a-3p表达。1.2.6
蛋白质印迹法（Western blotting）检测细胞中TCF7的蛋白表达提取各组细胞蛋白，BCA定量，电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃过夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃2 h。加发光液，曝光。1.2.7
双荧光素酶报告基因检测实验构建TCF7 3’UTR-WT（含TCF7 3’UTR片段）和TCF7 3’UTRMUT（含TCF7 3’UTR片段突变体）荧光素酶报告载体，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。
2 结果
2.1 唑来膦酸抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭
MTT法和Transwell实验检测结果如表1、图1所示，与对照组相比，ZOL组HOS细胞在48、72 h时细胞活性，细胞迁移量和侵袭量均显著降低，差异有统计学意义（P
＜0.05）。
图1 Transwell检测唑来膦酸（ZOL）对骨肉瘤细胞迁移数和侵袭数的影响（结晶紫染色×200）
表1 唑来膦酸（ZOL）抑制骨肉瘤细胞增殖、降低细胞迁移数和侵袭数/±s
2.2唑来膦酸调控骨肉瘤细胞miR
-520a
-3p的表达
与对照组（1.00±0.13）相比，ZOL 10 μmol/L组（1.88±0.16）、ZOL 50 μmol/L组（4.73±0.56）、ZOL 250 μmol/L组（4.95±0.62）HOS细胞中miR-520a-3p的表达量均显著升高（F
=64.667，P
＜0.001）。2.3 过表达miR
-520a
-3p抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭
结果如表2所示，与miR-con组相比，miR-520a-3p组HOS细胞在48、72 h时，细胞活性、细胞迁移量和侵袭量显著降低（P
＜0.05）。
表2 过表达miR-520a-3p抑制骨肉瘤细胞增殖以及减少细胞迁移数和侵袭数的影响/±s
2.4 miR
-520a
-3p靶向骨肉瘤细胞TCF7检测结果
miRcode预测 显 示，miR-520a-3p与TCF7 3’UTR之间存在结合位点（图2A）；双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-con组（1.00±0.12）相比，miR-520a-3p组（0.42±0.06）WT-TCF7细胞中荧光活性显著降低（t
=7.488，P
=0.002），MUT-TCF7细胞中miRcon组（0.95±0.09）与miR-520a-3p组（1.13±0.12）的荧光活性不受影响（t
=2.079，P
=0.106）。miR-con组、miR-520a-3p组、anti-miR-con组、anti-miR-520a-3p组TCF7蛋白表达水平分别为（0.39±0.05）、（0.17±0.05）、（0.36±0.04）、（0.67±0.06）（F
=49.990，P
＜0.001），miR-520a-3p组低于miR-con组（P
＜0.05），anti-miR-520a-3p组高于anti-miR-con组（P
＜0.05），说明miR-520a-3p靶向负调控TCF7表达（图2B）（P
＜0.05）。
图2 miR-520a-3p靶向调控骨肉瘤细胞T细胞特异性转录因子7（TCF7）表达：A为miR-520a-3p与TCF7靶向的序列信息，B为miR-520a-3p对骨肉瘤细胞TCF7表达的影响
2.5 抑制miR
-520a
-3p逆转唑来膦酸对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用
结果如表3所示，与对照组相比，ZOL组HOS细胞在48、72 h时，细胞活性、细胞迁移量和侵袭量显著降低；与ZOL+antimiR-con组相比，ZOL+anti-miR-520a-3p组HOS细胞在48、72 h时，细胞活性、细胞迁移量和侵袭量显著升高；与ZOL+anti-miR-520a-3p-si-con组相比，ZZOL+anti-miR-520a-3p-si-TCF7组HOS细胞 在48、72 h时，细胞活性、细胞迁移量和侵袭量均显著降低（P
＜0.05）。与对照组相比，ZOL组TCF7表达显著降低；与ZOL组相比，ZOL+anti-miR-520a-3p组TCF7显著升高；与ZOL+anti-miR-520a-3p-si-con组相比，ZZOL+anti-miR-520a-3p-si-TCF7组TCF7显 著 降 低（P
＜0.05）。见图3。
图3 抑制miR-520a-3p和唑来膦酸（ZOL）对骨肉瘤细胞T细胞特异性转录因子7（TCF7）表达的影响
表3 抑制miR-520a-3p表达可以逆转唑来膦酸（ZOL）对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用/±s
3 讨论
唑来膦酸是一种双磷酸盐类药物，其具有较好的临床疗效，尤其针对发生骨转移的癌症。李欣晓等在唑来膦酸治疗骨转移恶性肿瘤的研究中阐明，唑来膦酸联合放射治疗可增强发生骨转移肿瘤的治疗效果，其机制与失活肿瘤信号通路、促进凋亡、调节肿瘤微环境等相关。早在2007年，何贤峰等、刘家国等已报道，唑来膦酸可通过抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭，促进其凋亡，抑制骨肉瘤的进一步恶化。最近冷华平等在骨肉瘤的研究中发现，唑来膦酸可通过调节COX-2（环氧合酶-2）、MMP-9（基质金属蛋白酶9）和TIMP1（金属蛋白酶组织抑制因子-1）的表达呈浓度依赖性抑制骨肉瘤细胞的恶性生物学行为。本研究发现，唑来膦酸可明显抑制HOS细胞增殖、迁移、侵袭，这与前人的研究结果均相似；且唑来膦酸可上调HOS细胞中miR-520a-3p的表达。
现普遍认为，miRNA能调控mRNA的翻译或降解，从而影响蛋白的表达。miRNA可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的进展过程。在乳腺癌组织和细胞中，miR-520a-3p表达显著下调，恢复miR-520a-3p表达通过下调CCND1和CD44抑制乳腺癌进展。过表达miR-520a-3p通过靶向下调EGFR抑制结直肠癌细胞迁移，促进细胞凋亡，并阻滞细胞周期于G/G期，抑制肿瘤生长。Wang等在骨肉瘤的研究中发现，右美托咪定可上调直接靶向蛋白激酶1（AKT1）的miR-520a-3p，miR-520a-3p可抑制MG63细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡，揭示右美托咪定可通过上调miR-520a-3p的表达水平来抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移并促进细胞凋亡，提示右美托咪定可以作为骨肉瘤治疗中的潜在治疗剂，且miR-520a-3p可以是骨肉瘤治疗中的潜在靶标。本研究发现，过表达miR-520a-3p可抑制HOS细胞的增殖、迁移、侵袭；深入研究发现，抑制miR-520a-3p可逆转唑来膦酸对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，且miR-520a-3p可靶向负调控TCF7表达，推测miR-520a-3p的功能可能与靶向TCF7存在一定相关性。
TCF7为高迁移率蛋白超家族成员，主要参与调控淋巴细胞的分化。其在多种肿瘤中均出现表达异常升高，参与肿瘤的恶性进程。TCF7在结直肠癌组织和细胞中高表达，敲除TCF7可显著抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭。在骨肉瘤组织和细胞中，TCF7蛋白过表达，过表达miR-192通过靶向下调TCF7抑制骨肉瘤细胞的恶性行为。本研究检测了唑来膦酸处理的HOS细胞中TCF7的表达发现，唑来膦酸可抑制TCF7的表达；深入研究发现，抑制miR-520a-3p可逆转唑来膦酸在HOS细胞中对TCF7表达的抑制作用，敲减TCF7逆转了抑制miR-520a-3p对唑来膦酸的骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
综上所述，唑来膦酸可能通过调控miR-520a-3p/TCF7轴抑制骨肉瘤HOS细胞的增殖、迁移和侵袭，为骨肉瘤治疗提供理论基础。
