蒲公英提取物调控程序化死亡基因5对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

卿海辉，张小舟，胡敏

作者单位：武汉科技大学附属孝感医院骨科三病区，湖北孝感432000

骨关节炎是一种退行性关节疾病，常发生于中老年人群。软骨损伤是骨关节炎发病的主要因素，软骨细胞增殖能力减弱、凋亡增加是软骨退变的主要原因，因此，促进软骨细胞的增殖并抑制其凋亡可减轻软骨损伤，对骨关节炎的治疗具有积极意义。蒲公英是一种多年生草本植物，具有清热解毒、抗炎消肿、利尿通淋等药理作用。研究显示，蒲公英总黄酮可降低阿尔茨海默病大鼠神经元细胞凋亡，改善大鼠记忆功能；蒲公英提取物可通过提高磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）蛋白表达水平促进大鼠骨骼肌细胞的增殖，降低脂多糖诱导的大鼠骨骼肌细胞炎症反应。目前，蒲公英提取物对软骨细胞增殖、凋亡的影响还未知。程序化死亡基因5（programmed death gene 5，PDCD5）是一种促进细胞凋亡的基因，其在骨关节炎软骨和滑膜中的表达明显高于健康组织，与骨关节炎的发生发展密切相关。本研究主要探讨了蒲公英提取物对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响及其是否可通过调控PDCD5表达发挥作用，以期为骨关节炎的治疗药物的研发提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

试剂与仪器蒲公英提取物由华中农业大学实验室提取，主要成分为黄酮。DMEM培养基（批号SH30022.01B）、胰蛋白酶（批号SH30243.01 B）、胎牛血清（批号SH30066.02）购自美国Hyclone公司，Trizol（批号50300413）、lipofectamine2000试剂盒（11668-019）购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒（批号：K1622）为购自美国Thermo公司，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批号20170707054）购自Millipore公司，MTT法试剂盒（批号20170623）购自武汉博士德公司，荧光定量PCR试剂盒（批号LB3597）购自美国Thermo公司，PDCD5（批号ab3219）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）（批号GR92375-1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（P21）（批号ab37168）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）（批号ab136285）、Bcl-2相关X（Bax）（批号ab7977）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（批号GR1001123）一抗购自美国Abcam公司，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin VFITC/PI）试剂盒（批号20180617）购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.2

标本来源从武汉科技大学附属孝感医院2018年1月至2019年6月获得接受关节置换的5例骨关节炎病人的关节软骨，所有病人影像学变化及病理特征均符合中华医学会骨科分会《骨关节炎诊疗指南（2018年版）》，以上标本的获得均经武汉科技大学附属孝感医院伦理委员会批准（XGLY2018-08-25）且病人知情同意。

1.2 实验方法

1.2.1

软骨细胞的分离与培养参考文献分离软骨细胞，无菌条件下用含有1%双抗的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）漂洗3次软骨标本组织，切取软骨层为软骨薄片，用含有双抗的PBS漂洗软骨薄片3次，手术刀将软骨组织切成1 mm的碎片并清洗，然后置于0.25%胰蛋白酶消化液中37℃消化30 min，弃去消化液；加入2～3倍的DMEM配制的0.2%Ⅱ型胶原酶37℃消化16 h，离心，弃上清；DMEM培养基洗涤3次，离心弃上清；加入20%胎牛血清/DMEM培养液5 mL，200目钢网过滤收集软骨细胞悬液，将细胞悬液稀释成2.5×10个/毫升接种于培养瓶中，37℃，5%二氧化碳培养箱中培养，待细胞密度达到90%时消化细胞进行传代，本实验采用2～3代细胞。

1.2.2

软骨细胞转染收集处于对数生长期的软骨细胞，以每孔1×10个细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞融合至50%～70%时，利用lipofectamine2000转染试剂盒分别转染PDCD5过表达载体（pcDNA3.1-PDCD5组）及阴性对照（pcDNA3.1组）、PDCD5小干扰RNA（si-PDCD5）及阴性对照（si-NC组）。转染6 h后，更换新鲜培养基，继续培养至48 h，收集细胞用于后续实验。

1.2.3

细胞分组未进行转染的软骨细胞分为对照组：不做任何处理，正常培养；不同浓度蒲公英提取物组：分别用2.5 g/L、5 g/L、10.0 g/L的蒲公英提取物干预。蒲公英浓度参考文献［9］。pcDNA3.1-PDCD5组、pcDNA3.1组软骨细胞均采用5 g/L的蒲公英提取物干预，分别记为蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1-PDCD5组、蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1组。

1.2.4

MTT法检测细胞增殖情况分别将对数生长期未进行转染的软骨细胞、pcDNA3.1-PDCD5组、pcDNA3.1组软骨细胞制备成单细胞悬液，调整浓度为2×10个/毫升，每孔100 μL细胞悬液接种于96孔板中。按照“1.2.3”分组进行处理，分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL浓度为5 g/L的噻唑蓝（MTT），培养箱中继续孵育4 h。取出培养板，每孔加入150 μL二甲基亚砜，待结晶紫溶解后，振荡混合均匀，于酶标仪490 nm波长处检测吸光度，每组3个复孔求平均值。

1.2.5

流式细胞仪检测细胞凋亡分别将对数生长期未进行转染的软骨细胞、pcDNA3.1-PDCD5组、pcDNA3.1组软骨细胞制备成单细胞悬液，调整浓度为2×10个/毫升，每孔1 mL接种于24孔板中，按照“1.2.3”分组处理。培养48 h后，胰蛋白酶消化，收集细胞。1 500 r/min离心5 min，弃去培养基，PBS清洗。取1×10个细胞，加入500 μL 1×结合缓冲液，避光加入10 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光放置15 min。然后加入5 μL PI，轻轻混匀，避光放置5 min后流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算凋亡细胞率。

1.2.6

蛋白质印迹法检测蛋白表达情况收集处理后细胞，加入含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液，4℃提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度；聚丙烯凝胶电泳分离目的蛋白，湿转至PVDF膜，5%牛血清蛋白室温封闭1.5 h；一抗（PDCD5、cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2、GAPDH）稀释后4℃孵育过夜，Tris-Hcl缓冲液（TBST）漂洗；二抗室温孵育1 h，TBST漂洗；电化学发光显影液显色，采集图片，Image J处理系统分析吸光度，GAPDH为内参进行灰度值比较。

1.2.7

实时荧光定量PCR检测细胞PDCD5 mRNA表达水平Trizol试剂提取细胞中总RNA，微量核酸仪检测提取的RNA的纯度和浓度。参照逆转录试剂盒将RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增条件：95℃10 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共进行35个循环。引物序列：PDCD5正向5'-CGGAATTCACCATGGCGGACGAGGAGC-3'，反向5'-CGGAATTCAATAATCGTCATCTTCATC-3'；GAPDH正 向5'-ACATCGCTCAGAGACCATGG-3'，反向5'-GAAGTTGAGGTCAATGAAGGC-3'。采用2法计算PDCD5 mRNA的相对表达水平。

1.3 统计学方法

SPSS 22.0软件进行数据分析。两组间比较采用成组

t

检验，多组间比较采用单因素方差分析，采用GraphPad Prism对实验数据进行图片的制作。

P

＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蒲公英提取物对骨关节炎软骨细胞增殖的影响

与对照组比较，不同浓度蒲公英提取物处理后，骨关节炎软骨细胞48 h、72 h增殖水平显著增加，cyclin D1水平增加，P21水平则降低，且随浓度的增加呈剂量依赖性（

P

＜0.05）。具体情况见图1、表1。

表1 蒲公英提取物对软骨细胞活性和cyclin D1和P21蛋白表达的影响/±s

图1 蒲公英提取物对细胞骨关节炎软骨细胞中cyclin D1和P21蛋白表达的影响

2.2蒲公英提取物对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

与对照组比较，不同浓度蒲公英提取物处理后，骨关节炎软骨细胞凋亡率显著降低，凋亡蛋白Bax水平降低，Bcl-2水平则升高，且随浓度的增加呈剂量依赖性降低（

P

＜0.05）。见图2、表2。

表2 蒲公英提取物对软骨细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响/±s

图2 蒲公英提取物对骨关节炎软骨细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

2.3 蒲公英提取物对骨关节炎软骨细胞中PDCD5表达的影响

与对照组比较，不同浓度蒲公英提取物处理后，PDCD5 mRNA和蛋白水平随浓度的增加呈剂量依赖性降低（

P

＜0.05）。见表3。

表3 蒲公英提取物对软骨细胞中程序化死亡基因5（PDCD5）mRNA和蛋白表达的影响/±s

2.4 抑制PDCD5表达对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响

与si-NC比较，抑制PDCD5的表达后，si-PDCD5组48 h、72 h增殖水平显著增加，细胞凋亡率显著降低，PDCD5、P21、Bax蛋白水平显著降低，cyclin D1、Bcl-2蛋白水平显著升高（

P

＜0.05）。见表4，5。

表4 抑制程序化死亡基因5（PDCD5）对软骨细胞活性和凋亡的影响/±s

2.5 过表达PDCD5能逆转蒲公英提取物对骨关节炎软骨细胞增殖的作用

与对照组组比较，蒲公英提取物5 g/L处理后，软骨细胞48 h、72 h增殖水平显著增加，PDCD5、P21水平显著降低，cyclin D1水平显著升高（

P

＜0.05）；与蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1组比较，蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1-PDCD5组软骨细胞增殖显著降低，PDCD5、P21水平显著增加，cyclin D1水平显著降低（

P

＜0.05）。见表6，7。

表6 过表达程序化死亡基因5（PDCD5）能逆转蒲公英提取物对软骨细胞活性的影响/±s

2.6过表达PDCD5能逆转蒲公英提取物对骨关节炎软骨细胞凋亡的作用

与对照组比较，蒲公英提取物5 g/L处理后，软骨细胞凋亡率显著降低，Bax水平显著降低，Bcl-2水平显著升高（

P

＜0.05）；与蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1组比较，转染pcDNA3.1-PDCD5后，蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1-PDCD5组软骨细胞凋亡率显著升高，Bax水平显著升高，Bcl-2水平显著降低（

P

＜0.05）。见表8。

表8 过表达程序化死亡基因5（PDCD5）能逆转蒲公英提取物对软骨细胞凋亡的凋亡蛋白表达的影响/±s

3 讨论

骨关节炎是骨科常见的疾病，主要发生于老年人群。骨关节炎又被称为退行性关节炎、增生性关节炎、骨关节病等，该病主要侵袭病人的关节软骨、滑膜组织、骨组织，临床常表现为关节疼痛，关节畸形，功能障碍，进而影响病人的活动能力。软骨细胞是软骨代谢活动的成分之一，参与软骨基质的合成。目前大量研究证实，骨关节炎的发生发展与软骨细胞的异常增殖和凋亡密切相关，促进软骨细胞的增殖和抑制其凋亡是骨关节炎治疗的主要途径。

蒲公英属于菊科植物，价格低廉、资源丰富。研究显示，蒲公英提取物可抑制胃癌、乳腺癌、宫颈癌等肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。研究显示，蒲公英提取物可减少葡聚糖硫酸钠结肠中的炎症状况和氧化应激。目前，蒲公英提取物对软骨细胞增殖和凋亡的影响还未知。本研究结果显示，蒲公英提取物处理软骨细胞后，细胞增殖水平、cyclin D1、Bcl-2蛋白水平随浓度的增加呈剂量依赖性增加，凋亡率、P21、Bax蛋白水平随浓度的增加呈剂量依赖性降低，说明蒲公英提取物可促进软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡，提示蒲公英提取物可能是骨关节炎的治疗的潜在药物。

表5 抑制PDCD5对软骨细胞中相关蛋白表达的影响/±s

表7 过表达程序化死亡基因5（PDCD5）能逆转蒲公英提取物对软骨细胞中相关蛋白表达的影响/±s

骨关节炎中软骨基质的破坏、软骨细胞异常丧失与疾病的发展密切相关，细胞凋亡在细胞丧失过程中发挥重要作用。PDCD5是北京大学疾病基因研究中心发现的凋亡相关基因，有研究显示，活动性类风湿关节炎病人的血清及关节液中PDCD5的水平升高。本研究结果显示，抑制PDCD5的表达后，si-PDCD5组骨关节炎软骨细胞增殖水平、cyclin D1、Bcl-2蛋白水平显著增加，细胞凋亡率、PDCD5、P21、Bax蛋白水平显著降低，提示PDCD5在骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡中发挥重要作用。本研究还显示，蒲公英提取物作用软骨细胞后，细胞中PDCD5表达降低，而过表达PDCD5逆转了蒲公英提取物对软骨细胞增殖和凋亡的影响，提示蒲公英提取物可能通过抑制软骨细胞中PDCD5表达促进细胞的增殖和抑制细胞凋亡。

综上所述，蒲公英提取物可促进骨关节炎软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡，其可能通过调控PDCD5的表达发挥作用。但本研究还存在一定的不足之处，仅在细胞层面探讨了蒲公英提取物对软骨细胞增殖和凋亡的影响，接下来将通过动物模型实验深入分析蒲公英提取物对膝骨关节炎模型小鼠的影响及其他可能的调控途径，为蒲公英提取物用于临床治疗骨关节炎提供实验依据。