氯氰菊酯对蚯蚓处理蔬菜废弃物过程中的毒性效应研究*

杨 斌，徐 阳，段睿洁，武 玲，张航瑜，徐昆龙

(1.云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 国际学院，云南 昆明 650201)

氯氰菊酯具有广谱杀虫、杀虫效率高、效果持久和低残留等特点，目前被广泛应用于蔬菜、粮食作物和果树等病虫害防治。当蔬菜废弃物中农药残留超过一定限度，随着生物机体的不断富集便会对机体产生严重的危害。已有研究表明：氯氰菊酯会影响动物机体抗氧化酶的活性[1]。张悦等[2]研究发现：低剂量的氯氰菊酯会使中华绒螯蟹胰腺出现空泡，肝小管基膜增厚；马萍等[3]发现：氯氰菊酯对小鼠具有肾毒性。蚯蚓素有“分解者”之称，以腐败的有机物为食，已有报道利用蚯蚓处理蔬菜废弃物可行性研究[4]，每克蚯蚓最高的处理效率为每天处理白菜干物质量0.066 g[5]，且能耗低、效率高。泰国已成功应用蚯蚓处理蔬菜废弃物，但蔬菜废弃物中残留氯氰菊酯是否会影响或阻碍蚯蚓正常生长目前尚未见报道。本研究通过短期接触试验和含氯氰菊酯蔬菜废弃物饲喂试验，分析氯氰菊酯对蚯蚓抗氧化系统、体壁和肠壁的病理损伤，探讨农残毒性与蚯蚓的量效关系，以保证利用蔬菜废弃物饲养蚯蚓时能正常地生长、发育和繁殖，为利用蚯蚓处理蔬菜废弃物氯氰菊酯的残留量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选取体质量为300～400 mg、有明显生殖环、清肠处理24 h 的赤子爱胜蚓(Eisemia foetideSavigny)。

1.2 试验方法

1.2.1 氯氰菊酯对蚯蚓的毒性

根据《化学品蚯蚓急性毒性试验》(GB/T 21809—2008)[6]进行滤纸接触试验。取45 条蚯蚓按体质量随机分成5组，每组9 条；设置氯氰菊酯剂量为0.743、1.274、2.335、4.140 和7.431 μg/cm2的5 个处理组对蚯蚓进行滤纸接触试验。记录蚯蚓48 h 的行为活动、症状表现、蚯蚓死亡时间及死亡数，确定蚯蚓48 h 的半数致死剂量(LC50)。

1.2.2 氯氰菊酯短期接触试验

取360 条蚯蚓按体质量随机分为4 组，每组3 个重复，每个重复30 条。根据急性毒性试验结果，分别以1/10 LC50、1/5 LC50和 LC50为低、中、高3 个剂量组；并以蒸馏水为对照组对蚯蚓进行短期接触试验，分别于24、48 和72 h 从每个重复中取5 条进行抗氧化指标测定，5 条用于蚯蚓体腔细胞损伤测定。

1.2.3 含氯氰菊酯蔬菜废弃物饲喂试验

取600 条蚯蚓按体质量随机分为4 组，每组3 个重复，每个重复50 条。按照《农药合理使用准则(三) 》(GB/T 8321.3—2000)[7]的规定，氯氰菊酯在叶类蔬菜上最多使用3 次，本试验以氯氰菊酯正常施用剂量106.2 mg/m2为低剂量组，以该剂量的2 倍和3 倍设置中剂量组和高剂量组对蔬菜废弃物进行染毒，另以该试验室种植未喷洒农药蔬菜为对照组，对蚯蚓进行蔬菜废弃物饲喂试验，于第7、14、21 和28 天分别从各花盆中取13 条蚯蚓，5 条进行抗氧化指标测定，5 条用于蚯蚓体腔细胞损伤测定，3 条用于饲养14 d后的蚯蚓组织病理学观察。

1.3 指标测定方法

参照王冰洁等[8]的方法对每重复中5 条蚯蚓进行粗酶液提取，粗酶中超氧化物歧化酶(SOD)活性运用酶标仪(美国BioTEK 公司)配合试剂盒(南京建成)进行测定；过氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量运用721 紫外分光光度计(上海佑科)配合试剂盒(南京建成)进行测定。

体腔细胞损伤参照朱江[9]的方法，每个重复中选取5 条蚯蚓提取体腔细胞，同时在生物显微镜(越视精密仪器有限公司，苏州)下应用血细胞计数板计数使体腔细胞密度在1×105～5×105个/mL，随后利用试剂盒(南京建成)进行处理，并通过BD 流式细胞仪(BD 公司，上海DHG-9101)进行测定。

于饲养14 d 后从各重复中各取3 条蚯蚓置于10%甲醛溶液中固定，随后进行组织切片制作，通过HE 染色在400×物显微镜(YB-220)下观察蚯蚓组织病变。

1.4 数据处理

各项数据采用SPSS 19.0 进行单因素方差分析，用Excel 进行数据统计，数据结果均用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 蚯蚓急性中毒症状及死亡情况

接触氯氰菊酯48 h 后，蚯蚓在0.743 μg/cm2剂量下出现红肿，活力下降；在1.274 μg/cm2剂量下出现出血，体节断裂；当剂量上升至2.335 μg/cm2时，红肿部分体节呈念珠状，身体变细；剂量达4.140 μg/cm2时，蚯蚓在接触到受试物时剧烈运动，3～5 s 后停止运动，并分泌黄色液体，出现出血、红肿现象；当剂量高于7.431 μg/cm2时，蚯蚓出现溃烂，甚至死亡。

由表1 数据可计算出蚯蚓48 h 死亡率与氯氰菊酯剂量的回归方程为：y=0.129 7x-0.08，R2=0.997，根据方程计算48 h 滤纸接触蚯蚓死亡率为50%的 LC50为4.472 μg/cm2。

表1 滤纸接触48 h 蚯蚓死亡情况Tab.1 Mortality of earthworms exposed to filter paper (48 h)

2.2 蚯蚓短期接触氯氰菊酯

2.2.1 对蚯蚓SOD 活性的影响

由图1 可知：与对照组相比，随着接触氯氰菊酯时间的延长，蚯蚓体内超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著降低(P＜0.05)；但各剂量组蚯蚓在接触氯氰菊酯24 和48 h 后的SOD 酶活性均高于接触72 h 的处理。

2.2.2 对蚯蚓POD 活性的影响

由图1 可知：与对照组相比，接触氯氰菊酯24 h 后，低、高剂量组蚯蚓POD 活性无显著差异(P＞0.05)，但中剂量组POD 活性显著升高(P＜0.05)；接触48 和72 h 后，试验组POD 活性显著降低(P＜0.05)。

2.2.3 对蚯蚓MDA 含量的影响

由图1 可知：与对照组相比，接触氯氰菊酯24 h 高剂量组MDA 含量显著升高(P＜0.05)，而中剂量组MDA 含量降低；在48 和72 h 试验组MDA 含量显著升高(P＜0.05)。

图1 不同剂量氯氰菊酯对蚯蚓处理后体内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性及丙二醛(MDA)含量的影响)Fig.1 Effects of different doses of cypermethrin on superoxide dismutase (SOD),peroxidase (POD)activity and malondialdehyde (MDA) content in earthworm

2.2.4 氯氰菊酯对蚯蚓体腔细胞的影响

由图2 可知：与对照组相比，蚯蚓在接触氯氰菊酯24 h 后中、高剂量组体腔细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例增加；在接触48 和72 h 后晚期细胞凋亡比例增加，其中高剂量组早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例均增加。此外，与对照组相比，蚯蚓在接触氯氰菊酯24 和48 h 后各试验组的活细胞比例降低；接触72 h 后中、高剂量组活细胞比例降低。

图2 同时间段下不同剂量氯氰菊酯对蚯蚓体腔细胞的影响)Fig.2 Effects of different doses of cypermethrin on coelom cells of earthworm at the same time

2.3 饲喂含氯氰菊酯蔬菜废弃物对蚯蚓的影响

2.3.1 对蚯蚓体内SOD 活性的影响

由图3 可知：与对照组相比，饲喂7 d 后试验组蚯蚓的SOD 活性显著升高(P＜0.05)；随着饲喂时间的延长(14、21 和28 d)，试验组与对照组相比SOD 活性显著降低(P＜0.05)。

2.3.2 对蚯蚓体内POD 活性的影响

由图3 可知：在饲喂14、21 和28 d 后，试验组与对照组相比POD 活性显著降低(P＜0.05)，但在饲喂7 d 低剂量组POD 活性显著降低(P＜0.05)，而中、高剂量组 POD 活性显著升高(P＜0.05)。

2.3.3 对蚯蚓体内MDA 含量的影响

由图3 可知：在饲喂7、14 和21 d 后，试验组与对照组相比MDA 含量显著升高(P＜0.05)；在饲喂28 d 后，低剂量组与对照组相比MDA 含量显著降低(P＜0.05)，而中、高剂量组MDA 含量显著升高(P＜0.05)；在饲喂14 d 试验组MDA 含量达到最大，随后降低。

图3 饲喂不同剂量氯氰菊酯蔬菜废弃物对蚯蚓处理后体内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性及丙二醛(MDA)含量的影响)Fig.3 Effects of vegetable wastes containing different doses of cypermethrin on activities of superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) and content of malondialdehyde (MDA) in earthworms

2.3.4 对蚯蚓体腔细胞的影响

由图4 可知：与对照组相比，饲喂7 d 时试验组体腔细胞早期凋亡的比例逐渐升高；饲喂14、21 和28 d 后试验组体腔细胞晚期凋亡的比例随着饲喂蔬菜农药残留量的增加出现不同程度的升高。饲喂7 d 低剂量组、饲喂14 d 中、高剂量组和饲喂21 d 低、中、高剂量组与同时间段对照组相比体腔细胞机械损伤比例较大。与饲喂7 d 相比，饲喂14 和21 d 各组间活细胞比例均有所降低，但在饲喂28 d 机械损伤细胞比例较小。

图4 同时间段下蚯蚓饲喂含不同剂量氯氰菊酯蔬菜废弃物对蚯蚓体腔细胞的影响)Fig.4 Effects of feeding vegetable wastes containing different doses of cypermethrin on coelom cells of earthworms at the same time

2.3.5 蚯蚓病理组织学检查

由图5 可知：饲喂蚯蚓含氯氰菊酯蔬菜废弃物14 d，对照组体壁含有较多的杯状细胞，上皮细胞排列整齐；环肌和纵肌细胞排列整齐，厚薄均匀；肠道假复层柱状上皮细胞结构完整，排列紧密，体腔膜上可见较多黄色细胞。低剂量组上皮细胞排列整齐，环肌和纵肌细胞排列整齐，厚薄均匀；肠道假复层柱状上皮细胞结构完整，排列紧密，体腔膜上可见较多黄色细胞。中剂量组环肌和纵肌细胞排列整齐，厚薄均匀；肠道黏膜上皮细胞排列较疏松甚至脱落，体腔膜上黄色细胞脱落。高剂量组表皮层局部可见少量上皮细胞脱落，环肌和纵肌细胞排列整齐，厚薄均匀；肠道黏膜上皮细胞排列较疏松甚至脱落，体腔膜上黄色细胞脱落。

图5 蚯蚓组织横切图(400×))Fig.5 Cross-section of the intestinal wall of earthworms

3 讨论

急性毒性试验研究表明：蚯蚓皮肤在接触到外来有害化学物质刺激时蚯蚓会分泌大量黄色液体、生殖节肿胀、全身出血，死亡蚯蚓体节变细，有的呈现念珠状，低剂量刺激时蚯蚓出现逃逸现象，该结果与赵丽倩[1]的研究结果一致；且蚯蚓接触氯氰菊酯48 h 的LC50为4.472 μg/cm2。当氯氰菊酯剂量低于0.617 μg/cm2时蚯蚓能正常生长，高于则导致其死亡，因此，利用蚯蚓处理蔬菜废弃物时，氯氰菊酯在蔬菜弃物中的残留量必须严格控制。

受到外源物质刺激后，机体活性氧产生和清除的动态平衡被打破，大量的活性氧自由基产生则阻碍了细胞的正常生理功能，并介导抗氧化酶SOD 的产生对其进行分解，抗氧化系统受到损伤则导致脂质过氧化进而导致细胞损伤或者死亡[10-11]。本研究表明：蚯蚓接触氯氰菊酯24 h 时，SOD 活性显著降低(P＜0.05)，可能是蚯蚓皮肤短时间接触造成损伤而导致。在饲喂含氯氰菊酯蔬菜废弃物7 d 后蚯蚓体内SOD 活性上升(P＜0.05)，可能是大量O2-产生需要更多的SOD 对其进行分解，分解产物H2O2在蚯蚓体内蓄积，同时致使中剂量组POD 活性在24 h 和7 d 上升，以维持机体抗氧化系统动态平衡，剂量过高则导致机体抗氧化系统受损，故使高剂量组蚯蚓接触氯氰菊酯24 h 后POD 活性无显著变化。在接触48 和72 h 以及饲喂14、21 和28 d 的试验中，随着时间延长机体抗氧化系统受损，SOD 和POD 活性显著降低(P＜0.05)，导致大量O2-蓄积，引起机体脂质过氧化产物MDA 含量升高，这与已有研究结果[12-14]一致。而在接触24 h 中剂量组和饲喂28 d 低剂量组MDA 含量降低可能是由于试验操作所致。

研究表明：黄色细胞具有与肝脏相似的功能，即具有收集和排除体腔中的排泄物、毒素的储存[15]和去毒性功能，同时黄色细胞是糖原和脂肪合成与储存[16]以及磷酸盐储存的场所。机体脂质过氧化导致细胞膜改变，进而导致组织病变。本研究发现：饲喂含有氯氰菊酯的蔬菜废弃物14 d，低剂量组蚯蚓上皮局部可见杯状细胞明显增多，环肌和纵行肌细胞排列整齐，厚薄均匀；肠道假复层柱状上皮细胞结构完整、排列紧密，黄色细胞消失，但中剂量组和高剂量局部可见少量体壁上皮细胞脱落，肠腔扩张，上皮细胞变性、坏死，周围黄色细胞出现坏死及细胞核消失。因此，蚯蚓机体黄色细胞的病变揭示机体受到不同程度损伤。

已有研究显示：蚯蚓体腔细胞通过吞噬活性参与伤口栓塞形成和再建膜，并参与向再生位点递送必需营养物和生长刺激分子[17]；同时体腔细胞中氯细胞分泌的核黄素能促进蚯蚓受伤组织中囊胚的形成，促进受伤组织再生[18]。本研究发现：与同时间段对照组相比，接触氯氰菊酯24、48 和72 h 以及饲喂含氯氰菊酯蔬菜废弃物7、14、21 和28 d，试验组蚯蚓体腔细胞晚期细胞凋亡比例升高。饲喂7 和14 d 时低、中剂量组间早期和晚期凋亡比例逐渐升高，随后21～28 d 逐渐降低。这可能与蚯蚓体腔细胞再生功能和自我修复功能有关，但在整个试验中蚯蚓机械损伤细胞占比较大可能与细胞前处理有关。

4 结论

蚯蚓接触氯氰菊酯剂量高于4.472 μg/cm2会对其抗氧化系统、体表体腔细胞造成不同程度的损伤；饲喂喷洒氯氰菊酯量达212.4 mg/m2叶类蔬菜会对蚯蚓抗氧化系统、体表体腔细胞以及体表、肠壁造成损伤从而影响蚯蚓正常生长、发育和繁殖。因此，利用蚯蚓处理蔬菜废弃物过程中，必须严格控制蔬菜中常用农药氯氰菊酯的残留量。