非小细胞肺癌组织长链非编码RNA LINC00265、microRNA-98-5p的表达及其临床意义*

张帆，刘威，龙永贵，赵飞，刘凌曦，胡同晨，彭华利，马智群

（乐山市人民医院胸心外科，四川乐山614000）

肺癌是最常见的肿瘤，其中多数患者为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），NSCLC 病死率高，危及患者生命安全[1-2]。目前，学者认为NSCLC 发病与环境恶化、不良生活习惯、microRNA（miRNA）及长链非编码 RNA（long noncoding RNA, lncRNA）异常表达、免疫逃逸、炎症反应、自噬等关系密切[3]，且lncRNA、miRNA 可相互调控，共同参与NSCLC 的发生、发展[4]。有研究发现，lncRNA LINC00265 在急性髓细胞性白血病（acute myelogenous leukemia, AML）患者中表达上调，其可能通过影响自噬进而抑制癌细胞凋亡，从而在AML 中发挥调控作用[5]；而microRNA-98-5p（miR-98-5p）在NSCLC 中呈低表达，其可能抑制NSCLC 细胞的增殖及转移，且可能是治疗NSCLC的潜在靶标[6]。但lncRNA LINC00265 在NSCLC 患者中的表达及与miR-98-5p、预后的关系鲜有报道。因此本研究通过测定NSCLC 患者lncRNA LINC00265、miR-98-5p 相对表达量，分析两者的相关性及与预后的关系，以期为NSCLC 的防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2016年1月—2017年12月在乐山市人民医院行根治性切除术的原发性NSCLC 患者97 例作为研究对象。其中，男性56 例，女性41 例；年龄45～72 岁，平均（59.03±10.27）岁；年龄＜60 岁35 例，≥60 岁62 例；淋巴结转移52 例，淋巴结未转移45 例；肿瘤≤3 cm 43 例，肿瘤＞3 cm 54 例；临床分期Ⅰ期30 例，Ⅱ、Ⅲ期67 例；腺癌40 例，鳞癌43 例，其他病理类型14 例；低分化41 例，中、高分化56 例；肺叶切除89 例，单侧全肺切除8 例。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有受试对象及家属签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准①符合NSCLC 诊断标准，经病理学确诊为NSCLC[7]；②术前无放化疗者。

1.2.2 排除标准①临床资料不完整；②合并严重脏器疾病、其他恶性肿瘤；③存在手术禁忌证。

1.3 主要试剂及仪器

利用Trizol 试剂（SBJ-L0055，南京森贝伽生物科技有限公司），miRNA 提取试剂盒（R6842-02，北京智杰方远科技有限公司），First Strand cDNA Synthesis Kit（TER016-1，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），miScript Reverse Transcription Kit（218060，美国Thermo Fisher 公司），TaqMan®Universal Master Mix（4444558，上海恪敏生物科技有限公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）仪（StepOneTM，美国ABI 公司）。

1.4 样本收集

收集NSCLC 患者术中切除的癌组织标本和癌旁正常组织标本（距癌组织＞3 cm），置于液氮罐中冻存24 h 后移至-70℃冷冻保存。

1.5 qRT-PCR 检测组织lncRNA LINC00265、miR-98-5p相对表达量

解冻冻存组织标本，利用Trizol 试剂/miRNA 提取试剂盒抽提总RNA，First Strand cDNA Synthesis Kit/miScript Reverse Transcription Kit 合成cDNA。采用TaqMan®Universal Master Mix 及qRT-PCR 仪对cDNA 进行扩增、检测。反应条件：94℃预变性4 min；93℃变性15 s，64℃退火30 s，共计40 个循环。 lncRNA LINC00265、miR-98-5p 分别以GAPDH、U6 为内参，引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA LINC00265、miR-98-5p 相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 生物信息学软件预测lncRNA LINC00265 与miR-98-5p的关系

利用生物信息学网站（http：//starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=lncRNA＆flag=target＆clade=mammal＆genome=human＆assembly=hg19＆miRNA=all＆clipNum=1＆deNum=0＆panNum=0＆target=LINC00265）对lncRNA LINC00265 与miR-98-5p 的关系进行预测分析。

1.7 随访

对97 例NSCLC 患者进行随访，以手术当日为随访起点，电话/门诊为主要随访方式，2020年12月31日或患者死亡为随访终点，记录患者术后情况，计算术后总生存时间（overall survival, OS）、无病生存期（disease-free survival,DFS）。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Pearson 法；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，影响因素的分析用Cox 回归模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌旁正常组织与癌组织lncRNA LINC00265、miR-98-5p相对表达量比较

NSCLC 患者癌旁正常组织与癌组织lncRNA LINC00265、miR-98-5p 相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），癌组织lncRNA LINC00265 相对表达量高于癌旁正常组织，miR-98-5p 相对表达量低于癌旁正常组织。见表2。

表2 癌旁正常组织与癌组织lncRNA LINC00265、miR-98-5p相对表达量比较 （n=97，±s）

表2 癌旁正常组织与癌组织lncRNA LINC00265、miR-98-5p相对表达量比较 （n=97，±s）

组别lncRNA LINC00265 miR-98-5p癌旁正常组织癌组织t 值P 值1.05±0.35 1.86±0.62 11.205 0.000 1.03±0.34 0.50±0.17 13.732 0.000

2.2 癌组织lncRNA LINC00265、miR-98-5p 表达水平与NSCLC患者临床病理特征关系

以lncRNA LINC00265 相对表达量平均值1.86为界限，分为低表达（47 例）和高表达患者（50 例）。以miR-98-5p 相对表达量平均值0.50 为界限，分为低表达（49 例）和高表达患者（48 例）。不同性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、手术方式患者癌组织的lncRNA LINC00265 和miR-98-5p 表达水平比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）；而有无淋巴结转移、不同临床分期和低分化患者癌组织的lncRNA LINC00265 和miR-98-5p 表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同临床病理特征患者lncRNA LINC00265、miR-98-5p表达水平比较 例

2.3 癌组织lncRNA LINC00265 与miR-98-5p 的相关性

Pearson 法结果显示，NSCLC 患者癌组织lncRNA LINC00265与miR-98-5p呈负相关（r=-0.580，P=0.000）（见图1）。生物信息学分析显示，lncRNA LINC00265 与miR-98-5p 存在靶向结合位点，两者可能存在靶向调控关系（见图2）。

图1 NSCLC患者癌组织lncRNA LINC00265与miR-98-5p的相关性

图2 lncRNA LINC00265与miR-98-5p存在靶向结合位点

2.4 癌组织lncRNA LINC00265、miR-98-5p 表达水平与NSCLC患者预后的关系

97 例NSCLC 患者随访36 个月，其中生存52 例，无病生存49 例。Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，结果显示，NSCLC 患者lncRNA LINC00265 高表达患者OS为25.44个月（95%CI：22.45，28.43），DFS为22.88个月（95%CI：19.81，25.95）；lncRNA LINC00265 低表达患者OS 为31.62 个月（95% CI：29.22，34.01），DFS 为31.17 个月（95%CI：28.66，33.68）。lncRNA LINC00265高表达与低表达患者的总生存率、无病生存率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=14.750 和17.552，P=0.000），lncRNA LINC00265高表达患者总生存率、无病生存率较低。见图3、4。

图3 NSCLC患者癌组织lncRNA LINC00265表达水平与OS的关系

图4 NSCLC患者癌组织lncRNA LINC00265表达水平与DFS的关系

miR-98-5p高表达患者OS为31.27个月（95%CI：28.91，33.64），DFS 为30.56 个月（95% CI：28.07，33.06）；miR-98-5p 低表达患者OS 为25.65 个月（95% CI：22.57，28.73），DFS 为23.01 个月（95% CI：20.11，26.51）。miR-98-5p 高表达与低表达患者的总生存率、无病生存率比较，差异有统计学意义（χ2=11.017 和11.205，均P=0.001），miR-98-5p 高表达患者总生存率、无病生存率较高。见图5、6。

图5 NSCLC患者癌组织miR-98-5p表达水平与OS的关系

图6 NSCLC患者癌组织miR-98-5p表达水平与DFS的关系

2.5 NSCLC患者预后因素的分析

表4 影响NSCLC患者预后的单因素Cox回归分析参数

表5 影响NSCLC患者预后的多因素Cox回归分析参数

3 讨论

NSCLC 是发并率和死亡率较高的呼吸系统肿瘤，目前，手术仍是治疗NSCLC 的重要手段，但因手术的创伤性及术后的高复发率，患者预后较差[8-9]。因此，寻找与NSCLC 发病相关，且可评估患者预后的指标，对及早干预，改善NSCLC 患者生存状况有积极意义。

lncRNA 是一类长链非编码RNA，其可调控炎症反应、染色体重构、免疫应答、自噬、个体发育、细胞增殖/凋亡、氧化应激等过程，与慢性阻塞性肺疾病、肺癌等密切相关[10-11]。有研究显示，lncRNA GABPB1-IT1 在NSCLC 中表达下调，其可能是治疗NSCLC 的靶点及评估预后的标志物[12]；另外，lncRNA GAS5 在NSCLC 中过表达，其有望成为诊治、评估NSCLC 预后的有效指标[13]。以上研究表明，NSCLC 病理变化可能与lncRNA 表达失调有关。有研究发现，lncRNA LINC00265 作为lncRNA 成员之一，在结直肠癌中表达升高，其可能通过调控有关靶基因的表达，促进结直肠癌的发生、发展[14]；另外，lncRNA LINC00265 在AML 患者骨髓及血清中过表达，其可能通过调节相关信号通路进而调节AML 细胞增殖、侵袭，具有诊断和评估AML 患者预后的潜在价值[15]。以上研究表明，lncRNA LINC00265 可能在多种肿瘤中发挥促癌作用。 本研究中NSCLC 患者癌组织lncRNA LINC00265 相对表达量高于癌旁正常组织，与其在AML 的趋势一致[15]，且NSCLC 患者癌组织lncRNA LINC00265 表达水平与淋巴结转移、临床分期、分化程度有关，提示lncRNA LINC00265 与NSCLC 患者的临床病理特征相关，其可能对NSCLC 的发生、发展起促进作用，推测lncRNA LINC00265 可能通过靶向结合相关基因，调节相关信号通路，促进NSCLC 细胞增殖、迁移，抑制癌细胞凋亡，从而影响NSCLC 的发生、发展，但具体机制有待深入研究。

miRNA 是机体一类非编码小RNA 分子，其可调节生长发育、血管生成，影响自噬，调控细胞凋亡、分化、迁移、增殖，参与免疫炎症，介导信号转导过程[16-17]。有研究发现，miR-98-5p 作为miRNA 家族的一员，其可靶向结合α-1，3-甘露糖转移酶进而抑制NSCLC 进展[18]；另外，miR-98-5p在NSCLC 中表达降低，其可能通过影响信号转导过程进而在NSCLC 的发生、发展中发挥作用[19]。以上研究证实，miR-98-5p 可能作为抑癌因子，在NSCLC 病变过程中发挥抑癌作用。本研究显示，NSCLC 患者癌组织miR-98-5p 相对表达量低于癌旁正常组织，与JIANG 等[6]研究结果一致，且癌组织miR-98-5p 表达水平与NSCLC 患者淋巴结转移、临床分期、分化程度有关，提示miR-98-5p 可能参与并影响NSCLC 病理变化，推测miR-98-5P 可能通过靶向结合有关基因，调节相关信号转导，从而参与调控NSCLC 进展，其具体作用机制仍需进一步探讨。

此外，生物信息学分析显示，miR-98-5p可能是lncRNA LINC00265 的靶基因，且本研究中NSCLC 患者癌组织lncRNA LINC00265 表达水平与miR-98-5p 呈负相关，提示lncRNA LINC00265 可能与miR-98-5p 靶向结合，共同调控NSCLC 的发生、发展，但其机制有待深入研究证实。本研究结果显示，lncRNA LINC00265 高表达、miR-98-5p 低表达患者36 个月OS 较低，提示lncRNA LINC00265、miR-98-5p 与NSCLC 患者预后相关，两者有望成为评估NSCLC 患者预后的辅助指标。进一步研究发现，淋巴结转移、临床分期、lncRNA LINC00265是影响NSCLC 患者预后死亡的独立危险因素，miR-98-5p 是影响NSCLC 患者预后死亡的独立保护因素，提示临床分期越高、淋巴结发生转移、lncRNA LINC00265 表达水平升高、miR-98-5p 表达水平降低均会增加NSCLC 患者发生不良预后的风险，及时测定肺组织lncRNA LINC00265、miR-98-5p相对表达量有助于及早诊治、评估NSCLC 患者预后。

综上所述，NSCLC 患者癌组织lncRNA LINC00265 表达上调，miR-98-5p 表达下调，两者呈负相关，均可能在NSCLC 发生、发展中起一定作用，且两者可作为评估NSCLC 患者预后的标志物。本研究存在随访时间较短，样本较少，且未深入探究lncRNA LINC00265、miR-98-5p 在NSCLC的作用机制，后期仍需进一步扩大样本量、延长随访时间，结合基础研究，为临床诊治NSCLC 提供新靶点增加说服力。