宫颈脱落细胞microRNA-508-3p、ROCK1的表达及其对宫颈癌的诊断价值研究*

何立群，袁婧，张舒云

（诸暨市人民医院病理科，浙江诸暨311800）

宫颈癌是全球女性第4 大常见癌症[1]。早期发现可显著降低宫颈癌患者治疗难度，延长生存时间[2]。上个世纪，以细胞学为基础的宫颈筛查在降低宫颈癌发病率和病死率方面取得了较大成功[3]。目前，宫颈脱落细胞学检查是临床常用的筛查宫颈癌危险人群的方法之一，特异性较高[4]。

MicroRNA（miRNAs）作为重要的基因调节因子，参与多种细胞内通路的调节[5]。而通过检测宫颈脱落细胞miRNAs 的表达来评估宫颈癌的相关报道较少。有研究发现，microRNA-508-3p（miR-508-3p）上调对宫颈癌细胞的形成及肺转移有抑制作用，miR-508-3p 在宫颈癌中发挥抑癌基因作用[6]。基础研究证实ROCK1 与宫颈癌细胞的增殖及侵袭有关[7]。为进一步明确miR-508-3p、ROCK1 在宫颈癌中的表达及其诊断价值，本研究检测宫颈脱落细胞（正常、宫颈上皮内瘤、宫颈癌）miR-508-3p、ROCK1 的表达水平，对两者的相关性、靶向关系进行探讨，并分析其与宫颈癌病理特征的关系，评估其对宫颈癌的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年2月-2019年9月诸暨市人民医院收集的宫颈脱落细胞标本172 例。其中正常组（病理检查正常）70 例，年龄32～60 岁；宫颈上皮内瘤变组（病理学检查为宫颈上皮内瘤变[8]）54 例，年龄34～57 岁；宫颈癌组（病理学检查为宫颈癌[8]）48 例，年龄31～55 岁。本研究经医院医学伦理委员会审批，所有受试者自愿参与实验且配合度较好。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准通过宫颈脱落细胞学检查，宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者符合相关诊断标准[8]；宫颈癌患者实施手术治疗；临床资料完整[包括年龄、绝经情况、肿瘤直径、宫颈癌的国际妇产科联盟 （International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期、淋巴结转移、病理类型]。

1.2.2 排除标准术前行放化疗、宫颈手术及子宫切除等治疗；宫颈不完整；患其他恶性肿瘤；年龄＜30 岁，或＞65 岁；孕妇或妊娠期女性；生殖道炎症性疾病[9]。

1.3 主要仪器与试剂

Trizol、PrimeScript RT 试剂盒、RNA 酶抑制剂由丹麦DAKO 公司提供，免疫显色试剂miR-508-3p、ROCK1、U6、GAPDH 引物由上海生工生物工程股份有限公司设计，离心机由上海精密仪器仪表有限公司提供，酶标仪由上海沃元科技有限公司提供，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 仪由杭州艾康生物技术有限公司提供，免疫组织化学试剂盒购自瑞士罗氏公司，ROCK1、GAPDH 相关抗体购自美国圣克鲁斯生物技术公司。

1.4 qRT-PCR

提取总RNA。将收集的全部宫颈脱落细胞标本保存于含细胞保存液的离心管中，离心弃上清液，加入Trizol 溶液，用移液枪反复吹打后转移至灭菌管中，放置10 min，加入0.2 ml 氯仿，混匀后冰上静置30 min，离心弃上清液，再转移至灭菌管中，加入等量的异丙醇，混匀后冰上静置15 min，离心弃上清液，加入75%乙醇焦碳酸二乙酯水溶液1 ml，混匀后离心弃上清液，倒置在吸水纸上吸干，加入10 μl DEPC 水溶液，冰上静置30 min 使RNA 充分溶解，或置入-80℃冰箱冷冻保存待用。再采用StemloopRT 法（反应体系：PrimeScript RT enzyme 0.8 μl，PrimeScript RT Buffer 2.0 μl，RNA 酶抑制剂0.2 μl，各基因RT 引物0.2 μl）在PCR 仪中进行逆转录，合成cDNA。反应条件：16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、5 min，4℃持续。qRT-PCR 反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共计40 个循环。其中miR-508-3p 以U6 为内参，ROCK1以GAPDH 为内参。采用2-ΔΔCt法计算mRNA 相对表达量，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 免疫组织化学

将收集的宫颈脱落细胞标本制成细胞薄片，通过免疫组织化学链霉素抗生物-过氧化物酶法检测ROCK1 蛋白。ROCK1 蛋白免疫组织化学阳性判定标准：ROCK1 蛋白在细胞质或细胞核中呈黄色或棕黄色表达。ROCK1 蛋白阳性表达率（%）=ROCK1 阳性细胞/全部脱落细胞×100%。

1.6 Western blotting

提取各标本中总蛋白，将提取出的蛋白100℃煮沸5 min，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，转膜，5%牛血清白蛋白室温密封1 h，加入一抗（1∶1 000 稀释）ROCK1 及GAPDH 4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液冲洗，加入相应二抗，室温孵育1 h，显色，暗室曝光，采用ImageJ 2x 软件分析灰度值。

1.7 荧光素酶报告实验

通过http：//www.targetscan.org 网站预测miR-508-3p 和ROCK1 的靶向关系，以及miR-508-3p 与ROCK1 3'-UTR 的结合位点。合成含miR-508-3p 结合位点的ROCK1 3'-UTR 启动子区序列，构建ROCK1 3'-UTR 野生型（wild type, WT）质粒（ROCK1-WT）。并在该质粒基础上构建ROCK1 3'-UTR 突变型（mutant type, MUT）质粒（ROCK1-MUT）。参照质粒提取试剂盒说明书进行操作。将ROCK1-WT、ROCK1-MUT 质粒分别与mimics NC、miR-508-3p mimics 质粒混匀后共转染。转染48 h 后通过荧光素酶试剂盒测定荧光素酶活性。

1.8 临床病理资料分析

查阅并统计行宫颈癌手术患者的年龄、绝经情况、肿瘤直径、FIGO 分期、淋巴结转移、病理类型（鳞癌及腺癌）。参照miR-508-3p 及ROCK1中位值将宫颈癌患者分为高表达组与低表达组，对上述两种基因与宫颈癌病理特征的关系进行分析。全部宫颈癌患者随访1年，统计其生存、死亡例数。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，方差分析的两两比较用SNK- q法；计数资料以构成比（%）表示，比较用χ2检验；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线；相关性分析用Pearson 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞miR-508-3p及ROCK1的表达

正常组、宫颈上皮内瘤变组、宫颈癌组脱落细胞miR-508-3p、ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA 阳性率、ROCK1 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较：与正常组比较，宫颈癌组和宫颈上皮内瘤变组miR-508-3p 降低（P＜0.05），ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA 阳性率、ROCK1 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与宫颈上皮内瘤变组比较，宫颈癌组miR-508-3p 降低（P＜0.05），ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA 阳性率、ROCK1 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。见表2和图1、2。

表2 各组宫颈脱落细胞miR-508-3p、ROCK1比较

图1 各组宫颈脱落细胞中ROCK1的表达 （免疫组织化学×200）

图2 各组宫颈脱落细胞ROCK1蛋白的表达

宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变组miR-508-3p 与ROCK1 mRNA 均呈负相关（r=-0.6678 和-0.5234，均P=0.000）。见图3、4。

图3 宫颈癌组miR-508-3p与ROCK1 mRNA的相关性散点图

图4 宫颈上皮内瘤变组miR-508-3p与ROCK1 mRNA的相关性散点图

ROCK1是miR-508-3p 的预测靶基因（见图5）。ROCK1-WT 中，miR-508-3p mimics 组与mimics NC组荧光素酶活性分别为（0.47±0.02）和（0.99±0.05），经t检验，差异有统计学意义（t=16.724，P=0.000），miR-508-3p mimics 组较低。ROCK1-MUT中，miR-508-3p mimics 组与mimics NC 组荧光素酶活性分别为（1.01±0.03）和（0.97±0.01），经t检验，差异无统计学意义（t=2.190，P=0.093）。

图5 Targetscan网站预测miR-508-3p与ROCK1的靶向关系

2.2 miR-508-3p、ROCK1 表达与宫颈癌临床病理特征的关系

不同FIGO 分期、有无淋巴结转移患者的miR-508-3、ROCK1 表达水平比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；而不同年龄、绝经情况、肿瘤直径、病理类型患者的miR-508-3p、ROCK1 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各临床病理特征宫颈癌患者miR-508-3p和ROCK1表达水平比较 [n=24，例（%）]

2.3 miR-508-3p、ROCK1 诊断宫颈癌和宫颈上皮内瘤变的ROC曲线

miR-508-3p 诊断宫颈癌的ROC 曲线下面积（area under curve, AUC）为0.946，敏感性为87.1%，特异性为100.0%，约登指数为0.871。miR-508-3p诊断宫颈上皮内瘤变的AUC 为0.851，敏感性为84.3%，特异性为79.6%，约登指数为0.639。见表4和图6。

ROCK1 诊断宫颈癌的AUC 为0.949，敏感性为89.6%，特异性为100.0%，约登指数为0.896。ROCK1诊断宫颈上皮内瘤变的AUC 为0.905，敏感性为77.8%，特异性为88.6%，约登指数为0.663。见表4和图6。

图6 miR-508-3p、ROCK1诊断宫颈癌和宫颈上皮内瘤变的ROC曲线

表4 miR-508-3p、ROCK1诊断宫颈癌和宫颈上皮内瘤变的ROC曲线参数

2.4 生存组和死亡组脱落细胞miR-508-3p、ROCK1的表达

随访1年后，48 例宫颈癌患者中生存42 例，死亡6 例。生存组与死亡组miR-508-3p 和ROCK1 mRNA 相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），生存组miR-508-3p 高于死亡组，ROCK1 mRNA 相对表达量低于死亡组。见表5。

表5 生存组与死亡组脱落细胞miR-508-3p、ROCK1 mRNA相对表达量比较

3 讨论

约90%宫颈癌死亡患者处于低收入和中等收入国家，特别是在艾滋病流行率较高的地区，这主要是由于预防、筛查机会及治疗选择有限[10]。目前仅凭细胞形态学改变作为诊断依据难以满足大面积宫颈癌筛查的需求[11]。随着基因筛查、分子生物学、蛋白组学等生物医学工程的不断发展，宫颈癌标志物的筛选及其靶向治疗的探索已成为临床研究的焦点[12]。

miRNAs 是一类小分子非编码RNA 序列，参与多种重要的生物学行为，在多种恶性肿瘤中均有miRNA 异常表达[13-16]。miR-508-3p是一种抑癌基因，在大肠癌[17]、乳腺癌[18]及胃癌[19]中呈低表达，上调miR-508-3p 可对肿瘤细胞的侵袭、转移、凋亡及增殖发挥调控作用，可作为肿瘤性疾病的潜在治疗靶点。HU 等[6]研究报道，miR-508-3p 在宫颈癌细胞和细胞系中呈异常低表达，其高表达可抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进宫颈癌细胞凋亡。ROCK1 作为Rho 家族成员，可通过Rho/ROCK 信号通路激活反向相关信号分子，参与癌细胞的增殖、侵袭及转移过程。在肿瘤的发生、发展中，ROCK1 可结合活化的Rho 蛋白，促使ROCK1 催化活性中心，诱导癌细胞肌动蛋白骨架重组，从而增强癌细胞运动能力[20]。现阶段关于miR-508-3p、ROCK1 与宫颈癌关系的研究多集中于病变组织检测或血清检查，而miR-508-3p、ROCK1 在宫颈脱落细胞中的检测尚未见研究报道。

自巴氏以形态学为基础创立的涂片宫颈脱落细胞学检查被应用于宫颈癌的筛查，宫颈癌患病率及病死率明显降低[21]。有研究发现，血清[22]、唾液[23]及尿液[24]等样本中能检测到miRNAs。相较于血清标本，宫颈脱落细胞miRNA 的表达更具有特异性。因此本研究通过检测健康人群、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者宫颈脱落细胞miR-508-3p、ROCK1 的表达，分析两者与宫颈癌临床病理特征及预后的关系。

本研究结果显示，miR-508-3p 相对表达量在正常组、宫颈上皮内瘤变组及宫颈癌组中依次递减，说明当miR-508-3p 呈低表达趋势时，宫颈病变越严重，而ROCK1 表达与之相反，同时暗示两者存在一定的负调控关系。相关性分析结果显示，宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变组miR-508-3p 与ROCK1 mRNA 均呈负相关，推测miR-508-3p 可能通过靶向负调控ROCK1 的表达，参与宫颈病变的发生、发展。荧光素酶报告实验结果表明，miR-508-3p 可能通过介导ROCK1 的表达来调节宫颈癌细胞的恶性生物学行为，进而对宫颈癌的发生、发展起到一定的调控作用，而关于两者与宫颈癌细胞生物学行为作用机制的研究有待进一步探讨。

本研究结果显示，miR-508-3p、ROCK1 表达水平与宫颈癌患者的FIGO 分期、淋巴结转移有关，而与年龄、绝经情况、肿瘤直径及病理类型无关。提示宫颈癌患者宫颈脱落细胞miR-508-3p 表达水平越低，ROCK1 表达水平越高时，患者病情恶化越严重。这对宫颈癌的早期诊断具有一定的辅助意义。ROC 曲线结果显示，miR-508-3p 和ROCK1诊断宫颈癌的AUC 分别为0.946 和0.949；miR-508-3p 和ROCK1 诊断宫颈上皮内瘤变的AUC 分别为0.851 和0.905，说明两者在宫颈癌的筛查中具有较好的诊断价值。随访1年后，生存组miR-508-3p高于死亡组，ROCK1 mRNA 相对表达量低于死亡组，说明两者对预后有预测作用。

综上所述，宫颈脱落细胞miR-508-3p、ROCK1 在宫颈癌患者中表达异常，其中miR-508-3p 下调，ROCK1 上调，两者呈靶向负调控关系，并与宫颈癌患者FIGO 分期及淋巴结转移密切相关，具有一定的宫颈癌诊断价值，可作为早期宫颈癌筛查的潜在生物学指标。