肌酸化学交换饱和转移加权成像评估大鼠胶质瘤模型肌酸浓度变化

唐湘雍，张玉忠，陈彦孜，丁 玲，沈苑玉，吴仁华*

(1.龙华区人民医院医学影像科，广东 深圳 518109；2.汕头大学医学院第二附属医院医学影像科，广东 汕头 515041)

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤[1]，影像学检查为主要诊断方法。传统MRI虽能准确显示肿瘤形态学特点及血供情况，但不能从分子层面评估病灶。磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy, MRS)能检测组织的分子成分，直观显示全脑分子变化水平，其缺点是组织分辨率低。化学交换饱和转移(chemical exchange saturation transfer, CEST)成像是由磁化传递技术发展而来的MR分子成像新方法，能从分子水平探测组织中特定物质浓度的变化并进行成像，获得空间图谱[2]，已用于脑肿瘤、脑梗死及癫痫等相关研究[3]。既往研究[4-7]表明，针对多数MRS能检出的代谢物可实现CEST成像，主要包括谷氨酸[4]、肌醇[5]和肌酸(creatine, Cr)[6-7]等。Cr是人体组织能量代谢过程中的重要物质[8]，目前已有学者[6-9]采用Cr-CEST成像研究心脏、肌肉及颅脑相关疾病。脑胶质瘤肿瘤区域细胞繁殖迅速，使能量代谢发生变化，导致Cr浓度改变。本研究观察Cr-CEST成像评估大鼠胶质瘤Cr浓度的价值。

1 材料与方法

1.1 体外实验 于直径8 mm试管中配置浓度为10 mmol/L的pH 7.0 Cr溶液，以浓度1%琼脂糖溶液固定，获得单一Cr试管；另于5支相同试管中分别配置浓度20、40、60、80、100 mmol/L，pH均为7.0的Cr溶液，并以相同方法固定于容器中，获得混合Cr试管；行MR扫描。

1.2 体内实验 选取8只6周龄雄性SD大鼠(购于广东省实验动物中心)，体质量200～250 g，中位数231.5 g。将10 μl对数生长期C6胶质瘤细胞(浓度为106个/10 μl)接种于大鼠右侧基底节区，制作大鼠胶质瘤模型。于造模后第2～3周采集大鼠头部MRI。本研究经汕头大学医学院实验动物伦理委员会批准(批准号：SUMC2013-039)。

1.3 仪器与方法

1.3.1 体外实验 采用安捷伦7.0 T动物MR仪(美国安捷伦科技有限公司)，配备双通道正交体线圈，行T2W、连续波点分辨波谱序列及连续波平面回波序列扫描。T2W参数：TR 2 500 ms，TE 80 ms，层厚2 mm。参考文献[10-11]方法设置连续波点分辨波谱序列及连续波平面回波成像序列扫描参数，以连续波点分辨波谱序列扫描单一Cr试管时，TR 6 000 ms，TE 26.51 ms，预饱和能量(B1)为0.5、1.0、3.0、5.0 μT，射频脉冲持续时间为4 s，体素3 mm×3 mm×3 mm，饱和偏移频率为+5～-5 ppm，间隔0.25 ppm；扫描混合Cr试管时，B1为1.0 μT，余同上。以连续波平面回波成像序列扫描混合Cr试管时，翻转角90°,TR 6 000 ms，TE 26.51 ms，矩阵64×64，层厚2 mm，FOV 40 mm×40 mm，采集次数2，B1 0.5、1.5、2.5 μT，射频脉冲持续时间为4 s，饱和偏移频率2.0、-2.0、300 ppm。

1.3.2 体内实验 连续波点分辨波谱序列参数：根据T2WI所见，于肿瘤区域避开出血及坏死区设置ROI，体素3 mm×3 mm×3 mm，B1为0.5 μT，射频脉冲持续时间4 s，FOV 30 mm×30 mm，余参数同混合Cr试管。连续波平面回波成像序列参数：B1 0.5 μT，射频脉冲持续时间4 s，FOV 30 mm×30 mm，余参数同混合Cr试管。

1.3.3 图像后处理 采用MATLAB(2013b)对原始数据进行后处理，通过连续波点分辨波谱序列图像获得试管及大鼠脑胶质瘤模型的Z谱及相应非对称谱；于连续波平面回波序列图像试管/大鼠脑胶质瘤中心区域(尽量与连续波点分辨波谱序列扫描ROI保持一致)及对侧正常组织放置体素为3×3个的方形ROI，测量其Cr-CEST效应Cr-CESTR值，Cr-CESTR=(M-2 ppm-M+2 ppm)/M0，M-2ppm、M+2ppm、M0分别为频率-2 ppm、+2 ppm、300 ppm处的信号强度，其中300 ppm处偏离水峰较远，相当于未施加预饱和脉冲，取其绝对值的均值为最后结果，并获得相应的Cr-CEST加权图。

1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0统计分析软件。计量资料采用中位数(上下四分位数)表示，比较采用Mann-WhitneyU检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外实验 于单一Cr试管的Z谱及非对称曲谱(图1)频率2.0 ppm处见明显波谷及波峰，提示存在Cr-CEST效应，且B1值为0.5～3.0 μT时Cr-CEST效应随其增高而上升，B1值升至5.0 μT后Cr-CESTR效应降低。

图1 不同射频预饱和能量下单一Cr试管的Z谱(A)及非对称曲谱(B)

混合Cr试管Z谱及非对称曲谱(图2A、2B)显示，频率2.0 ppm处Cr-CEST效应随Cr浓度升高而增强。混合Cr试管Cr-CEST加权图像(图2C)亦显示，Cr-CEST效应随Cr浓度升高而增强，试管由蓝色向红色转变，且随B1值升高，Cr-CEST效应增强。B1值为0.5 μT时，20、40、60、80及100 mmol/L Cr试管的Cr-CESTR分别为6.31%、9.91%、14.46%、18.07%及21.45%；1.5 μT时，相应Cr-CESTR分别为16.75%、28.49%、37.66%、45.73%及49.87%；2.5 μT时分别为21.34%、34.84%、42.64%、50.75%及53.28%。

图2 混合Cr试管的Cr-CESTR效应相关图谱 A、B.分别为B1为1.0 μT时的Z谱(A)及非对称谱(B)；C.B1 为0.5、1.5、2.5 μT时混合Cr试管的Cr-CEST加权图像

2.2 体内实验 成功制备8只大鼠胶质瘤模型，肿瘤T2WI呈高信号，边界不清，占位效应明显(图3A)。大鼠脑胶质瘤Z谱及非对称曲谱(图3B、3C)显示，B1值为0.5 μT时，于频率2.0 ppm处见水信号减低，提示存在Cr-CEST效应；Cr-CESTR加权图(图4)显示，肿瘤区域颜色较对侧正常脑组织为浅，即Cr-CEST效应低于对侧，频率2.0 ppm处肿瘤区域Cr-CESTR绝对值[0.098(0.012,0.393)%]低于对侧正常脑组织区域[3.499(3.072，3.656)%，Z=-3.361，P<0.001]。

图3 大鼠脑胶质瘤模型Cr-CESTR效应相关图谱 A.T2WI，黑框区域为扫描ROI；B.Z谱；C.非对称谱

图4 大鼠脑胶质瘤模型Cr-CEST效应图 A.T2WI；B.Cr-CEST加权图(方框为ROI)

3 讨论

CEST技术利用特定高斯分布的预饱和脉冲对溶质中的特定物质进行预饱和，即射频标记。假设有两个溶质池，一个是自由水池，一个是可交换质子池。由于MR能探测氢质子信号，却无法直接探测特定大分子质子池的信号。多种大分子物质内含有可与自由水进行化学交换的氢质子，在适当条件下(如适宜的温度、pH)，交换质子池中的氢质子能与自由水池的氢质子发生化学交换，通过磁化传递探测水信号变化，间接反映溶质中特定的低浓度物质变化，从而显示组织微环境的变化程度。CEST成像弥补了MRS空间分辨率低、不能获得图像的不足，得到探测物质的CEST效应图可直观显示特定溶质分子微观状况下的浓度分布及变化。

SCHMIDT等[12]指出，温度升高使CEST效应增强；而pH对CEST效应亦存在影响。本研究在恒定室温、pH 7.0下进行观察，以减少其他因素对Cr-CEST效应的影响。SUN等[13]发现B1与CEST效应并非呈无极限正相关，能量增高到一定程度后，CEST效应将发生溢出，即减低，故优化CEST扫描参数具有重要意义。本研究通过试管实验优化扫描参数，发现相同条件下，B1值为0.5～3.0 μT时，Cr-CEST效应随B1值增高而加强，而B1值增高至5.0 μT时CEST效应发生溢出[13]而有所下降；提示在一定范围内提高B1值可提升Cr-CEST效应，但并非B1值越高则交换速率越快。随Cr浓度增高，Cr-CEST效应增强，与既往研究[12]结果相符，这是由于浓度增高后，相同条件下质子池内可交换质子增多，导致交换增多，使水信号减低更明显，而Cr-CEST效应增强。

在体实验中的最佳B1值与Cr试管扫描并非完全相同。SINGH等[6]采用较低B1值(1.45 μT)对健康成人行头部Cr-CEST成像。考虑到脑组织Cr浓度较低，其CEST效应相对试管而言较为微弱，较大B1值不利于活体成像，且B可能导致脑组织温度增高而损害脑细胞，进而影响实验结果，本研究采用B1值0.5 μT对大鼠脑胶质瘤进行Cr-CEST扫描，结果显示大鼠胶质瘤频率2.0 ppm处Cr-CEST效应绝对值较对侧正常脑组织减低，提示其Cr浓度低于正常脑组织，与既往Cr-CEST研究[6,11]结果基本相符，并与MRS显示脑胶质瘤肿瘤区域N-乙酰天门冬氨酸、Cr减低和胆碱增高[14]相呼应。

由于频率-2.0～-3.5 ppm处存在核奥式效应[15-16]，无法去除-2.0 ppm处及附近部分物质交换的影响，计算Cr-CEST效应时，-2.0 ppm处存在水信号减低，难免影响结果，故Cr-CEST成像并非是绝对浓度成像，此为本研究不足之处。

综上，Cr-CEST成像有助于评估大鼠脑胶质瘤模型Cr浓度变化，有望为活体检测脑内Cr代谢提供影像学新方法。