青牛胆茎节组织培养关键技术研究

张潇月，温朝平，周 宇，董凯密，陈 华，王仁睿，侯大斌，杨玉霞，余 马

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010；2.四川省中医药科学院中药材品质及创新中药研究四川省重点实验室，成都 610041）

青牛胆（Tinospora sagittata）为防己科青牛胆属草质藤本植物，主要分布于湖北西部和西南部、陕西南部、四川东部至西南部、西藏东南部、湖南、江西等地［1］，其块根名为金果榄，是常用中药，含有生物碱、萜类、甾醇类等活性成分［2］，主要用于治疗咽喉肿痛、痈疽疔毒、痢疾等疾病［3］。由于国家对中医药行业的大力支持，市场对金果榄的需求量急剧增加，使得青牛胆野生资源被无序采挖，趋于短缺。为了解决这一问题，人工栽培青牛胆是实现该药材可持续发展的重要途径。

组织培养技术具有繁殖系数高、品种遗传稳定性高、不受季节和自然条件限制等优点，可实现种苗的大批量生产［4］。目前针对青牛胆的组织培养报道较少，刘艳等［5］建立了青牛胆的组培快繁体系，确定了消毒时间、嫩茎和嫩叶愈伤组织的诱导培养基、腋芽的诱导培养基和生根培养基。本课题组以刘艳等［5］报道的快繁体系为参考，建立青牛胆的组织快繁体系，前期试验发现茎段不同节间的出芽率存在较大差异，且在继代培养时存在丛生芽长势较弱、叶色较浅的情况。因此，本研究以青牛胆茎段为材料，筛选腋芽最佳诱导培养基，研究不同节间对腋芽诱导的影响及不同培养基对壮苗的作用，以期为青牛胆的规模化生产提供技术支持，对青牛胆优质种苗的工厂化生产具有重要的实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料

青牛胆采自四川峨眉山，引种于西南科技大学生命科学与工程学院龙山实验基地温室中栽培，选取青牛胆生长状态一致的茎段为材料。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒 将青牛胆枝条根据茎节所在部位不同进行编号，顶端的茎段标记为①号，以下的带芽茎节依次标记为②～⑥（图1a）。将茎段分别剪成1.0～1.5 cm长带1个节的茎段（图1b），按照不同编号进行收集。去除叶片，用饱和洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲净，75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗2次，0.1%升汞溶液+1～2滴吐温-20振荡消毒7 min，无菌水冲洗4次，无菌滤纸吸干多余的水分备用。

1.2.2 茎段不同节间的腋芽诱导 切去茎段两端与升汞溶液接触的部分，将茎段依次接种于MS+0.2mg/L 6-BA+0.5 mg/LKT+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3启动培养基［5］培养4周。培养基中添加蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH为5.8，培养温度为（24±2）℃，光照强度为1 800 lx，光照时间为12 h/d。

1.2.3 增殖培养 将诱导出的腋芽（＞0.5 cm）切下，接种于新鲜的MS+0.2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.5 mg/L GA3培养基上进行增殖培养4周，培养环境同上。

1.2.4 壮苗试验 将增殖后较弱的丛生芽分成单株，挑选高度一致的苗接种于MS和MS+10 mL/L乙二胺四乙酸铁钠（EDTA-Fe）2种培养基上进行壮苗培养4周，培养环境同上。

1.2.5 生根培养 将壮苗后的植株转至1/2 MS+0.5mg/L IBA+0.5 mg/L NAA［5］进行生根培养6周，培养环境同上。

1.2.6 移栽炼苗 待生根完成后，逐渐打开瓶口，使生根苗逐渐适应外界环境，炼苗1周后，取出小苗，洗净根部的培养基，用0.5%多菌灵溶液浸泡小苗根部10 min，清洗晾干后，移至灭过菌的珍珠岩+园土（1∶1）基质中培养，相对湿度70%～80%，加强通风，1个月后统计成活率。

1.3 试验设计与数据调查

每个处理接种10个外植体，重复3次，茎段不同节间的腋芽诱导试验于培养4周时统计诱导率和＞0.5 cm的腋芽数量，壮苗试验培养4周时统计平均株高和叶色情况。采用SPSS 17.0软件进行显著性分析。

诱导率=（萌芽的外植体数量/接种外植体总数）×100%。

褐化率=（褐化的外植体数量/接种外植体总数）×100%。

2 结果与分析

2.1 茎段不同节间对腋芽诱导的影响

在诱导培养基上培养3 d后可观察到腋芽开始萌动（图1c），培养4周后茎段不同节间在同一种诱导培养基上对腋芽的诱导情况存在很大差异，随着①号茎节至⑦号茎节位置的变化，腋芽的诱导率和＞0.5 cm的腋芽数量逐渐降低，褐化率逐渐增高。①号茎节的诱导率为93.3%，显著高于其他部位，褐化率为13.3%，＞0.5 cm的腋芽数量为6.7个，除了与②号茎节的褐化率和腋芽数量差异不显著外，显著优于其他部位。⑥和⑦号茎节的诱导率分别为26.7%和20.0%，显著低于其他部位，褐化率达50.0%、63.3%，＞0.5 cm的腋芽数量分别为2.3、2.0个（表1）。

表1 不同茎节对腋芽的影响

2.2 不同培养基对壮苗效果的影响

铁盐对青牛胆组培苗的壮苗效果起着关键作用，在壮苗培养基里生长4周后，生长在MS+10 mL/L EDTA培养基的组培苗平均苗高为4.1 cm（图2），平均叶片数量为6.5片，叶色浓绿（图1d）。生长在MS培养基的组培苗平均苗高和平均叶片数量均显著低于前者，分别为2.8 cm和3.3片，叶色较淡（图1d）。

图2 不同壮苗培养基对平均苗高和叶片数量的影响

3 讨论

目前青牛胆的组织培养相关研究很少，已报道的青牛胆［5］和青牛胆属部分植物如宽筋藤［6］、心叶青牛胆［7］建立的快繁体系并未研究不同茎节对腋芽诱导的影响。本研究在刘艳等［5］建立的组培快繁体系基础上，着重研究不同茎节对腋芽诱导的差异，并证明培养基中添加10 mL/L的EDTA-Fe是有效的壮苗方式，解决了青牛胆增殖丛生芽孱弱的问题，有效地提高了种苗的质量。①号茎节的诱导率和＞0.5 cm的腋芽数量分别达93.3%和6.7个，显著高于其他茎节，随着茎节位置的变化，诱导率和＞0.5 cm腋芽数量显著降低，褐化率升高，证明茎节的幼嫩程度对腋芽诱导的影响较大，木质化程度越高的茎节越容易褐化。在实际生产中，为了增大外植体的数量，并保证较高的诱导率，可以使用①～⑤号茎节作为外植体，平均诱导率为67.3%，平均褐化率为32.7%，＞0.5 cm的平均腋芽数量为4.5个。⑥、⑦号茎节木质化程度高，平均诱导率为23.4%，平均褐化率达56.7%，不适合选作外植体。

茎节作为外植体进行腋芽诱导已在多种药用植物上有所应用，如灯油藤（Celastrus paniculatus）［8］、白花苋（Aerva sanguinolenta）［9］、穿心莲（Andrographis paniculata）［10］、短蕊万寿竹（Disporum cantoniense）［11］、公石松［12］等。据研究，不同位置的茎节对腋芽诱导的效率不同。Gitonga等［13］报道澳洲坚果靠近顶端的1～3号茎节对腋芽的诱导效果优于靠近基部的4～6节；Shirdel等［14］报道玫瑰基部茎节的腋芽萌发率最高，为30%，腋芽长度为5.75 cm，中间茎节的腋芽萌发率最低，为17.4%，腋芽长度为2.8 cm。以上研究说明不同植物不同位置的茎节对腋芽的诱导情况不同。刘艳等［5］报道的青牛胆腋芽诱导率为45%，应是多个位置的节间混合而得的平均诱导率。本研究结果表明，①号茎节腋芽诱导率最高，随着位置向下变化，腋芽诱导率逐渐降低，由此可见，筛选节间位置可有目的地进行取样，并有效提高腋芽诱导率。

褐化容易造成植物死亡，是组织培养过程中一个重要的问题，这主要与植物体酚类化合物的含量有关，当植物体表面形成伤口，酚类化合物氧化，形成黑色或褐色螯合物，导致植物部分变暗［15，16］。不同位置的茎节在组织培养过程中褐化程度不同，这是因为多酚类化合物在木质化程度高的组织中合成较多，在木质化程度低的幼嫩组织中合成较少［17］。石榴顶端茎节（1.5 cm）在组培过程中褐化程度最轻，基部茎节褐化程度最重［18］，这与本研究结果一致，青牛胆①、②号茎节的褐化率为20%以下，③～⑦号茎节的褐化率增至40%以上。由此可见，在外植体的选择上，选择幼嫩、褐化程度较轻的茎节可极大地降低褐化率，提高成活率。

植物种苗经增殖阶段后，容易出现丛生芽孱弱的现象，影响生根和后期移栽效果，为了使种苗健壮，需要在增殖之后进行壮苗培养。据报道，在壮苗培养阶段，在培养基中添加一些物质如GA3［19］、VB1［20］、蛋白胨［20，21］、水解酪蛋白［22］等，可有效提高种苗的生长势，另有研究表明种苗在含高浓度的细胞分裂素上生长后适当降低或去除细胞分裂素，对壮苗有一定的促进作用［4］。常立国等［23］将马铃薯弱苗放置于不含激素的3MS上生长，壮苗效果最佳，茎秆粗壮、叶片多、叶面积大。本研究使用了不添加激素的MS培养基和MS+EDTA-Fe 2种培养基，MS培养基对壮苗有一定的效果，但MS+EDTA-Fe培养基壮苗效果更优。于艳等［24］在建立多年生麻栎组培体系过程中，初代培养基、继代培养基和生根培养基中均使用2倍铁盐，有效提高了多年生麻栎茎段的不定芽诱导率和再生植株成活率；Papathanasiou等［25］报道将培养基中的可溶性铁浓度降低后，马铃薯种苗在随后的培养中出现枯黄的现象，这些报道均说明了铁盐对于组培苗尤其是叶片生长具有重要的促进作用。本研究在MS培养基中另外增加了10 mL/L EDTA-Fe后，种苗生长健壮，叶色浓绿，证明该浓度的铁盐适合青牛胆种苗生长。

研究了不同节间对腋芽诱导的影响，确定了适合用作外植体的具体节间位置，并筛选了壮苗培养基，该组织培养体系可为青牛胆的工厂化生产提供技术指导。