褪黑素处理对盐胁迫下苦荞萌发及幼苗生长的影响

石桃雄，朱丽伟，王红霞，黄 娟，陈庆富

（贵州师范大学荞麦产业技术研究中心，贵阳 550001）

褪黑素是一种小分子激素类物质，在1917年被首次发现于牛脑松果体中，该种未知物质可以让蛙皮肤黑色素褪色变白［1］。至1958年，褪黑素的化学结构才被鉴定出，命名为Melationin［2］。1969—1995年，又有很多学者相继在不同地区的被子植物中检测出该种物质，含量较低，为ng/g水平［3，4］。但在某些药用植物的种子中，褪黑素含量可达μg/g水平［5］。

近年来，随着人们对褪黑素研究的深入，发现褪黑素在植物抗逆性反应中至关重要。徐向东等［6］研究了外源褪黑素对高温胁迫下黄瓜幼苗活性氧（ROS）代谢的影响，发现褪黑素能抑制黄瓜叶片ROS产生，提高抗氧化酶系的活性和抗氧化物质的占比，维持脂膜的完好性，增强幼苗对高温逆境的抵抗能力。Zhang等［7］研究发现，褪黑素能够显著提高盐胁迫下黄瓜种子的发芽率，以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，外源褪黑素能诱导抗氧化物质基因表达以减少盐胁迫引起的氧化损伤。Li等［8］研究发现，施加1μmol/L褪黑素能够减少湖北海棠叶片氧化损伤，减缓叶绿素的降解，提升叶片的光合速率，有效缓和盐胁迫对湖北海棠生长的胁制作用。盐胁迫对大豆苗期铁氧还蛋白基因PetF的表达也具有抵制作用，而添加适宜浓度褪黑素能够加强大豆中该基因的表达［9］。褪黑素能提高小麦幼苗的耐旱能力，使其根系的吸水能力变强，还可使其气孔张开，蒸腾作用速度加快，提升植物光合能力，使其快速恢复生长［10］。多胺能维持细胞的完整性，减轻低温造成的细胞膜伤害。研究发现，外源褪黑素处理烟草悬浮细胞后，细胞内精氨酸脱羧酶活性增强，致使细胞内多胺的含量增加，以提高对低温的抗性［11］。

荞麦生长周期短（80～100 d）、抗旱、耐瘠，营养和保健作用良好，是中国重要的小宗杂粮作物。荞麦膳食纤维高于小麦、大米和玉米等谷类作物，且含有谷类作物没有的芦丁（维生素P）和叶绿素等成分，能降低人体血脂和胆固醇含量，有抗辐射、抗氧化、防治心血管病和脑血管出血等作用［12］。盐胁迫是造成农作物生长危害的主要原因之一，土壤盐渍化对全球农业发展具有重要影响。为了充分利用盐渍化土地，抗逆性强且营养价值丰富的荞麦成为适宜的作物之一。为研究褪黑素对苦荞盐抗性的作用，本研究以苦荞自交系WTX2为试验材料，研究褪黑素处理对盐胁迫下苦荞的萌发、根长、幼苗鲜干重、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性的变化规律，以期为提高苦荞耐盐能力研究提供方法依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苦荞种子由贵州师范大学荞麦研究中心提供，为稳定的苦荞自交系WTX2，种子在做此研究前先进行了盐浓度筛选，最终选取了浓度为100 mmol/L的NaCl溶液；褪黑素处理条件为25℃的黑暗环境。

1.2 试验方法

1.2.1 发芽试验

1）溶液配制。100 mmol/L的NaCl溶液：取5.85 g NaCl溶解后，定容至1 000 mL，备用。1 000μmol/L的褪黑素溶液：取褪黑素0.232 3 g，用微量无水乙醇溶解后定容到1 000 mL。用水稀释配制成浓度为100和1 000μmol/L褪黑素溶液。褪黑素溶液配制过程尽量避光，然后将配好的溶液避光保存于4℃冰箱中备用。

2）种子精选。选取均匀饱满的WTX2种子，放入去离子水中多次冲洗，祛除杂质，进行二次筛选。最后，将精选好的种子自然风干，分别用不同浓度的褪黑素于黑暗条件下处理6 h后取出，水处理作为对照（CK），晾干，备用。

3）发芽管理。试验用的发芽盒规格为12 cm×12 cm，盒底部铺双层充分浸泡过盐溶液的发芽纸，然后将苦荞种子播于发芽纸上，放入智能光照培养箱中，培养温度为25℃，16 h光照和8 h黑暗条件下循环。以胚根突破种皮1 mm为发芽标准，每日固定时间记录发芽种子数，并及时给发芽纸补充NaCl溶液保持胁迫。在培养的第7天，每个处理取20棵幼苗，分别测根长、鲜重和干重。

1.2.2 酶液制备 分别在培养的第0、2、4和6天时取样测定丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性。取0.3 g苦荞幼苗，分3次加入8 mL磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.8），研磨至匀浆状态，在10 000 r/min条件下离心15 min，取上清液作为酶粗提取液。各项指标参考《植物生理生化实验原理和技术》中的方法［13］。其中，MDA测定采用硫代巴比妥酸法；SOD测定采用氮蓝四唑（NBT）还原法；CAT测定采用H2O2法。

1.3 数据处理

采用Excel软件结合SPSS20.0统计软件对数据进行整理、方差分析和图表制作。

2 结果与分析

2.1 外源褪黑素对盐胁迫下苦荞种子萌发的影响

由表1可知，不同浓度褪黑素处理后，苦荞种子的发芽率、发芽势、发芽指数和平均发芽时间均和对照无显著差异，而经1 000μmol/L褪黑素处理后，种子的活力指数显著高于CK，说明适宜浓度的褪黑素处理可明显提高苦荞种子的耐盐能力。

表1 褪黑素处理对盐胁迫下苦荞种子萌发的影响

2.2 外源褪黑素对盐胁迫下苦荞根长和生物量的影响

由表2可知，与CK相比，100和1 000μmol/L褪黑素处理的种子在高盐条件萌发时，其幼苗各项指标均较好。使用1 000μmol/L褪黑素处理后的种子幼苗根比CK长29.2%，幼苗鲜重和干重分别比CK高15.0%和15.4%。特别是幼苗鲜重显著大于CK。

表2 褪黑素处理对盐胁迫下苦荞幼苗根长、鲜重和干重的影响

2.3 外源褪黑素对盐胁迫下苦荞幼苗MDA含量的影响

由图1可知，高盐胁迫下，苦荞生长过程中其幼苗MDA含量均处于先下降后上升的趋势，不同浓度褪黑素处理下幼苗MDA含量有一定的差异。CK处理的苦荞种子在萌发第0、2和4天时幼苗MDA含量差异不显著，但在萌发第6天时含量显著升高，比第4天高258.2%；在施加褪黑素为10、100和1 000μmol/L浓度时，种子萌发第2天之后幼苗MDA含量均显著上升，但上升幅度均较CK低，与萌发第4天相比、第6天的MDA含量分别升高了111.7%、129.4%和37.0%。

图1 褪黑素处理对盐胁迫下苦荞幼苗MDA含量的影响

2.4 外源褪黑素对盐胁迫下苦荞幼苗抗氧化酶活性的影响

由图2可知，各处理的种子在盐胁迫萌发过程中，SOD酶活性都具有下降的变化趋势，不同处理间又有明显的区别。CK和10μmol/L处理的种子在萌发第0～4天时，SOD酶一直维持较高的活性，萌发至第6天时酶活性显著下降，与第4天相比，分别下降了63.8%和51.2%；经100和1 000μmol/L褪黑素处理的种子，在萌发第0～2天活性较高，萌发至第4天时活性有轻微下降，萌发至第6天时活性下降明显，与第4天相比，分别下降了45.1%和29.0%，差异并未达到显著水平。

图2 褪黑素处理对盐胁迫下苦荞幼苗SOD酶活性的影响

由图3可见，各处理的种子在高盐胁迫萌发过程中，幼苗CAT酶活性均有不同程度的变化。CK处理的种子在萌发第0、2、4和6天时，CAT酶活性呈下降、上升又下降的变化趋势，由萌发第0天的2.642 nmol/g·min（FW）降 至 第6天 的0.208 nmol/g·min（FW）；10μmol/L褪黑素处理的种子CAT酶活性呈先上升后下降的变化趋势，在萌发第2天时，CAT酶活性显著高于第0天，萌发第2～6天CAT酶活性呈缓慢下降的变化趋势，不同萌发天数间差异不显著；100μmol/L褪黑素处理的种子CAT酶活性呈下降的变化趋势，萌发至第2天时CAT酶活性显著低于第0天，萌发至第2～6天时CAT酶活性呈缓慢下降的变化趋势，不同萌发天数间差异不显著；1 000μmol/L褪黑素处理的种子萌发过程中CAT酶活性无显著变化，萌发第0、2、4、6天时CAT酶活性分别是1.285、1.889、1.490和1.505 nmol/g·min（FW）。

3 讨论

有研究表明，褪黑素可以促进小麦种子萌发，提高胚芽鞘长度和初生根数［14］，增加滁菊幼苗鲜重和干重［15］。水稻幼苗植株进行75 mmol/L Nacl胁迫15 d，喷洒200μmol/L褪黑素使植株干重显著增加［16］。0.1～100μmol/L褪黑素处理明显缓解水稻砷胁迫，其根长和鲜重均有明显提高［17］。在本研究中，10μmol/L褪黑素处理对苦荞应对盐胁迫促进作用有限。100、1 000μmol/L褪黑素处理显著降低了苦荞盐胁迫的毒害作用，苦荞种子活力指数、鲜重均明显高于CK，根长和干重也高于CK。

在植物遭遇高低温、盐碱等逆境胁迫时，细胞膜透性会有所增加。植物体内的丙二醛（MDA）含量是衡量细胞膜受氧化伤害程度最好的指标，其含量的大小可以直接反映细胞膜受伤的程度［18，19］。徐向东等［4］研究表明，施加外源褪黑素后的黄瓜幼苗叶片MDA的含量随着褪黑素浓度的增大而减小，并且显著低于对照组。黄益宗等［17］在砷胁迫下，对水稻叶片喷施0.1～100μmol/L褪黑素，也显著减少水稻叶片MDA的累积。本研究结果与前人的研究结果一致，盐胁迫会导致苦荞幼苗中MDA含量增加，而褪黑素处理能有效缓解高盐对细胞膜的伤害，降低苦荞幼苗的MDA含量。

SOD和CAT是在植物保护系统中起重要作用的两种酶，在植物处于逆境条件时，它们能通过相互协作，减少活性氧，降低植物细胞受伤害的程度［20］。在本研究中，盐胁迫条件下，苦荞种子经100、1 000 μmol/L褪黑素处理后，SOD和CAT酶活性虽然也处于下降的变化趋势，但与CK相比，其变化是缓慢的，且萌发至第6天时，褪黑素处理的种子幼苗CAT酶活性均明显高于CK。本研究结果与刘仕翔等［21］、余雪娜等［22］、刘月等［23］研究结果一致，表明褪黑素处理植物可提高其抗氧化物酶系统活性，减少逆境条件下产生的活性氧，进而降低植物受伤害程度。

4 小结

使用100、1 000μmol/L褪黑素浓度处理苦荞种子，可减缓高盐对细胞膜的伤害作用，使SOD和CAT酶活性维持相对较高水平，显著减缓高盐对苦荞幼苗的毒害作用，使幼苗的根长、鲜重和干重均优于对照。