柱前衍生化LC-MS/MS法同时测定人血浆中炔雌醇和依托孕烯及其药动学研究

2021-09-01陈晓茹洪富美

药学与临床研究 2021年4期

陈晓茹，洪富美，2*

1 徐州医科大学，徐州 221000；2 徐州立兴佳正医药科技有限公司，徐州221009

去氧孕烯炔雌醇片主要活性成分含炔雌醇（EE）和依托孕烯（ENG）。该制剂连续用药后依托孕烯血药浓度稳态为（4500±40）pg·mL-1[1]；炔雌醇血药浓度稳态为（410±21）pg·mL-1[2]。依托孕烯促进炔雌醇引发的性激素结合球蛋白（HBG）增高，因而可使血内游离睾酮降低且是选择性最高的孕激素。目前对炔雌醇和依托孕烯等类固醇的血药浓度进行检测的酶联免疫法[3]、UPLC-MS/MS[4]及GC-MS/MS[5]柱前衍生法[6]多存在样品制备量大，血浆用量多，基质效干扰等问题，以及MS 源中前体离子的复杂裂解。因此很难达到检测的较低血药浓度的要求。本研究采用LC-MS/MS 分析方法，与其它分析方法相比有更高的选择性和灵敏度，高通量且样本前处理方法简单。现采用此法研究健康女性受试者餐后口服去氧孕烯炔雌醇片中炔雌醇与依托孕烯的药代动力学特征。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

LC-MS/MS系统；ExionLCTMAC液相色谱仪（AB SCIEX 公司），包括IonDriveTMTurbo VTM离子源，AC Pump 二元泵，QTRAP® 6500+质谱检测器，AC Autosampler 自动进样器；MSA6.6S-0CE-DM 分析天平、BSA623S 分析天平（Sartorius 公司）；DC200H超声波清洗器（Delta 公司）；DMT-2500 多试管涡旋混合仪（米欧仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

炔雌醇对照品（EE，中国食品药品检定研究院，批号：100052-201210，纯度：99.4%）；依托孕烯对照品（ENG，批号：2-JLM-19-1，纯度：98%）、炔雌醇-2，4，16，16-d4（批号：1-HMA-37-1，纯度：96.7%）均为TRC 公司产品；依托孕烯-d6（TLC 公司，批号：1147-073A4，纯度：98.4%）；去氧孕烯炔雌醇片（南通联亚药业，批号：19108007，0.15 mg/30 μg）；去氧孕烯决雌醇片（N.V.Organon，批号：N029591，0.15 mg/30 μg）；甲醇、乙腈、甲酸（色谱级）；碳酸钠、正己烷、丙酮（AR 级）；甲基叔丁基醚、丹磺酰氯（色谱级）；水为去离子水。

空白血浆来源于临床试验健康志愿者剩余标本，血浆分离后于冰箱-80 ℃保存备用。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18（Narrow Bore RR 2.1×100mm，3.5μm）；柱温：40℃；流动相A：0.1%甲酸水溶液,流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液，洗液50%乙腈水溶液，梯度洗脱（0～2.6min，流动相A%为45%；2.6～6.3min，流动相A%为20%；6.3～7.8 min，流动相A%为1%；7.8～9.0 min，流动相A%为45%）；流速：0.4800 mL·min-1；自动进样器温度6 ℃；进样量：25 μL；分析时间：9.00 min。

采用正离子扫描模式，多反应监测通道（MRM），电喷雾离子化（ESI），气帘气体（CUR）30 kPa，离子化温度（TEM）700 ℃，离子源气体1（GS1）379 kPa，离子源气体2（GS2）414 kPa，喷雾电压27.5 kPa。待测物参数见表1。

表1 待测物的质谱参数

2.2 溶液的配制

以甲醇为溶剂，配制100 ng·μL-1的炔雌醇储备液，加入甲醇逐级稀释，得到1 pg·μL-1的炔雌醇储备液；以甲醇为溶剂，配制100 ng·μL-1的依托孕烯储备液。以50%甲醇-水为稀释溶剂逐级稀释至含炔雌醇和依托孕烯分别为2、50pg·mL-1，5、100pg·mL-1，10、200 pg·mL-1，20、500 pg·mL-1，50、1000 pg·mL-1，100、2000 pg·mL-1，300、6000 pg·mL-1，500、1×104pg·mL-1的混合工作溶液。以甲醇为溶剂，分别配制成100 ng·mL-1的炔雌醇和依托孕烯储备液。以50%甲醇-水为稀释溶剂，配制0.15、3 pg·μL-1的炔雌醇和依托孕烯内标混合工作溶液。以配制的50%乙腈和0.2%甲酸的水溶液为复溶液，以水为溶剂配制6 mg·mL-1碳酸钠溶液，配制0.5 mg·mL-1丹磺酰氯丙酮溶液。

衍生溶液配制：以6mg·mL-1碳酸钠溶液-0.5mg·mL-1丹黄酰氯溶液（4∶15，V/V）为稀释溶液配制含炔雌醇100 pg·μL-1、依托孕烯1000 pg·μL-1、炔雌醇内标10 pg·μL-1、依托孕烯内标100 pg·μL-1的高浓度混合溶液，以及含炔雌醇1pg·μL-1、依托孕烯100pg·μL-1、炔雌醇内标10 pg·μL-1、依托孕烯内标100 pg·μL-1的低浓度混合溶液。

基质溶液配制：用已配制的乙腈-甲酸复溶液为配制含有炔雌醇、依托孕烯、炔雌醇内标和依托孕烯内标的高、中、低基质溶液，使其炔雌醇内标浓度均为0.02pg·μL-1，依托孕烯内标浓度均为0.4pg·μL-1，同时炔雌醇和依托孕烯的浓度分别为0.4、8.5 pg·μL-1，0.25、5 pg·μL-1，0.06、0.15 pg·μL-1，所有溶液均保存在冰箱内4 ℃备用。

2.3 样品制备步骤

血浆样品前处理：精密吸取300 μL 受试者的血浆样品于12 mL 的玻璃试管中，加入甲醇-水（50∶50）15 μL，涡旋5 min，加入40 μL 内标混合标准溶液（0.15、3 pg·μL-1），涡旋混匀。空白样本及残留样本加入甲醇-水（50∶50）40 μL，涡旋混匀，加入正己烷-甲基叔丁基醚（50∶50）3 mL，涡旋2 min 混匀，于3000 r·min-1离心5 min。取上层有机相于40 ℃条件下，以空气气流蒸发干燥20 min。

衍生化处理：在上述得到的血浆样品固体物中加入8 mg·mL-1碳酸钠溶液30 μL，涡旋2 min 混匀，再加入1 mg·mL-1丹磺酰氯丙酮溶液75 μL，涡旋2 min 混匀，水浴60 ℃保持10 min。涡旋混合1 min，于40 ℃条件下，以空气气流吹干。然后向其中加入300 μL 复溶液，复溶并涡旋混匀，将制备好的样本转移至试管中，放置在96 深孔板中备用。

2.4 临床试验方案

本研究采用两制剂（去氧孕烯炔雌醇片、Marvelon®）双周期、交叉方式的试验设计。20 名女性确认为健康受试者，体重不低于45 kg，年龄18～40 周岁。受试者于给药期间不服用葡萄柚/柚子或含此类成分的食物或饮料。试验期间统一高热量、高脂肪饮食，每周期在餐后情况下服用2 片0.15 mg/30 μg受试制剂或参比制剂。两次服药间隔28 d 为清洗期。实验方案经本校附属医院伦理委员会批准，受试者自愿参加试验并签署知情同意书。

给药后4 小时内，受试者应意识清醒，并保持直立站姿，避免剧烈活动。于给药前（60 min 内）和给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、12、24、36、48、72、96、125 h 由静脉采血8 mL 于肝素化试管中，分离出血浆于冰箱-80 ℃保存待测。

2.5 专属性考察

炔雌醇衍生物、依托孕烯及内标的保留时间分别为5.7、2.2、5.7、2.2 min，无杂峰干扰测定。见图1。

图1 分析物LC-MS 图

2.6 标准曲线及定量下限（LOQ）

配制含炔雌醇浓度分别为2、5、10、20、50、100、300、500 pg·mL-1且含依托孕烯浓度分别为50、100、200、500、1000、2000、6000、1×104pg·mL-1的混合标准含药血浆各300μL，在每支标准含药血浆离心管中精密加入混合内标标准溶液（0.15、3pg·μL-1）40 μL，涡旋混匀。按“2.3”项下步骤制备样品，计算分析物（炔雌醇衍生物和依托孕烯）和内标（炔雌醇-2、4、16、16-d4和依托孕烯-d6）的色谱峰面积比值。以峰面积比值对血浆中分析物的浓度（X）权重回归计算，得到炔雌醇回归方程Y=5.16×10-2X+1.59×10-2、r=0.9986；依托孕烯回归方程Y=3.62×10-3X+9.44×10-4、r=0.9989，权重系数为w=1/x2。结果表明，炔雌醇在2～500 pg·mL-1、依托孕烯在50～1×104pg·mL-1范围内线性关系良好。本方法测定血浆中炔雌醇和依托孕烯的LOQ 分别为2 pg·mL-1和50 pg·mL-1。

2.7 精密度和准确度试验

配制低、中、高浓度质控样本：炔雌醇浓度分别为2、6、40、250、400 pg·mL-1且依托孕烯浓度分别为50、150、800、5000、8500 pg·mL-1的混合质控样本。上述样本按“2.3”项下步骤制备样品，测定3 个分析批。每批包含定量下限，低、中、高浓度质控样品（每个浓度有6 个平行样本），一组标准曲线样品，一个零浓度样本（空白样品只添加内标物无分析物），一个空白样本。结果表明，炔雌醇和依托孕烯批内精密度最大值分别为6.7%和4.9%（不包含LOQ），批间精密度最大值分别为5.0%和5.2%（不包含LOQ）。LOQ质控样品的批内精密度分别为6.7%和8.2%，批间精密度分别为8.5%和6.0%。炔雌醇与依托孕烯批内准确度分别为-4.9%～1%、-5.2%～1.9%（不包含LOQ），批间准确度分别为-2.7%～-1.5%、-4.2%～-2.1%（不包含LOQ）。LLOQ 质控样本的批内准确度分别为5%、-2.6%，批间准确度分别为0.6%、1.0%。见表2～5。

表2 LC-MS/MS 法测定炔雌醇批内准确度与精密度结果（，n=6）

表3 LC-MS/MS 法测定炔雌醇批间准确度与精密度结果（，n=3）

表4 LC-MS/MS 法测定依托孕烯批内准确度与精密度结果（，n=6）

表5 LC-MS/MS 法测定依托孕烯批间准确度与精密度结果（，n=3）

2.8 基质效应评估及提取回收率

2.8.1 基质效应考察配制低、中、高（炔雌醇浓度为6、250、400 pg·mL-1）浓度的6 个不同来源的空白血浆，即形成含生物基质的样本；以纯水为基质，且按“2.3”项下步骤制备，以“2.2”项下制备的低、中、高浓度的基质溶液代替“2.3”项中的复溶液，配制成与生物基质浓度相同的样本，即不含生物基质的样本；依托孕烯（浓度为150、5000、8500pg·mL-1）的空白基质检测同炔雌醇。

配制加入5%经冻融后血细胞破裂的全血的溶血样本，以溶血样本制备低、高（炔雌醇浓度6、400 pg·mL-1、依托孕烯浓度为150、8500 pg·mL-1）浓度的质控样本，每个浓度平行5 个样本，并与分析批一同制备与分析，计算各自的平均浓度与理论值；加入2%脂肪乳注射剂的高血脂样本，5 个以高血脂空白样本配制与溶血样本浓度相同的低、高浓度样本，并与分析批一同制备与分析，计算各自的平均浓度与理论值。结果表明，炔雌醇和依托孕烯无明显空白基质效应，溶血基质效应，高血脂基质效应结果见表6。

表6 基质效应（，n=5）

2.8.2 提取回收率按“2.3”项下步骤制备低、中、高（炔雌醇浓度分别为6、250、400 pg·mL-1；依托孕烯浓度分别为150、800、8500 pg·mL-1的混合质控样本）浓度样本，分别加入内标溶液，每个浓度平行4个样本，即为制备后样本。将空白血浆样本按照“2.3”项下步骤制备，以“2.2”项的低、中、高浓度的基质溶液代替“2.3”下的复溶液进行制备，每个浓度平行4 个样本，即为非制备后样本。将上述样本分析评价，计算每一种浓度及每一种化合物制备后的样本平均响应值/非制备后样本的平均响应值×100%，考察提取回收率。提取回收率的CV≤15%与提取总回收率符合要求，结果见表6。

2.9 稳定性试验

配制中、高（炔雌醇浓度分别为6、400 pg·mL-1，依托孕烯浓度分别为150、8500 pg·mL-1的混合质控样本）浓度质控样本若干份，其中3 份按“2.3”项下方法处理后，立即测定；另取3 份在室温放置25h，结果平均准确度偏差为7.6%、-4.5%、-1.6%、-6.2%，CV分别为6.2%、3.3%、7.1%、5.4%；3 份制备后样品的稳定性测试，在自动进样器6 ℃下放置33 h（炔雌醇），67 h（依托孕烯），结果平均准确度偏差为-3.5%、-9.0%、-5.7%、-4.6%，CV 为6.4%、3.3%、6.5%、4.9%；3 份样本做冷冻与解冻稳定性测试，在冰箱-20 ℃、-80 ℃冷冻与解冻5 个循环，结果稳定。基质中分析物在冰箱（理论-80 ℃）下放置0、32、63、98 d稳定。

2.10 药动学应用

将建立的并经过完整方法学验证检测的分析方法应用于临床血浆样本的分析。作随机、开放、单中心、单剂量、交叉实验，给予20 名中国健康女性受试者餐后使用去氧孕烯炔雌醇片（每片含去氧孕烯0.15 mg、炔雌醇30 μg），按照不同时间点采集血浆，得到炔雌醇tmax、依托孕烯tmax，两成分AUC0-t见表7。此数据与国外已上市同品种、同剂量的去氧孕烯炔雌醇片Marvelon 的主要药动学参数进行比较，结果具有一致性，见表7；平均血药浓度-时间曲线见图2。

表7 本研究与Marvelon®的炔雌醇与去氧孕烯主要药动学参数比较

图2 平均血药浓度-时间曲线图

3 讨论

本研究采用丹磺酰氯柱前衍生法提高炔雌醇分析信号，炔雌醇是苯酚羟基反应在丹磺酰氯的仲胺部分通过亲核芳族取代而衍生，丹磺酰氯与酚羟基，伯胺和仲胺反应，炔雌醇的电离能力低且核心结构不完整，因此丹磺酰氯的衍生化过程会产生仲氮基团，使分子易于被电离。调节质谱参数找到前体离子及子离子，且分析时基本无内源性干扰，经过一次液液萃取同时定量两种药物的浓度，分析临床受试者的平均血药浓具有一致性。

柱前衍生化可较好地改善药物浓度低、信号差的问题[7]，可以定量极低浓度的炔雌醇及依托孕烯。实验发现，当pH>8 时进行衍生反应，用复溶液进行稀释，调节有机相比例，避免了溶剂效应，流动相为甲酸水溶液、甲酸乙腈溶液，调节不同的洗脱梯度，将洗脱梯度拉长使保留时间后移就可达到较好的洗脱效果。由于定量下限极低，对样本制备环境的要求较为关键，改变以往的蛋白沉淀法，采用液液萃取法减少时间成本且得到较为纯净的生物样本。