柴桂感寒口服液对靶动物的安全性试验

朱经国，刘明研，于美玲，肖 蕊，施 君，胡庭俊*，韦英益*

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004; 2.广西百色农业学校，广西百色 533099)

柴桂感寒口服液为河南牧翔动物药业有限公司研发的中兽药复方制剂，该药组方源自《伤寒论》[1]，系“小柴胡汤”加减方，是由柴胡、桂枝、干姜、黄芩4味主药及天花粉、牡蛎、栝楼根和炙甘草等辅药组成；该方兼 “小柴胡汤”的清利胆热之功及桂枝、干姜之温阳散寒，栝楼根、牡蛎之清热生津、化痰散结之功于一体[2]。柴桂感寒口服液主要针对因冷热交替、气温骤降等因素导致鸡群打喷嚏、流鼻涕、轻度发热等风寒感冒之症状而研发，根据我国兽药审评中心发布的《兽药研究技术指导原则》[3]，在新兽药临床前药效学研究中，应提供药物推荐剂量和过量的安全性资料。本试验对柴桂感寒口服液进行靶动物(鸡)的安全性试验，观测其对靶动物(鸡)的临床体征、饮食欲、血常规、血液生化指标等的影响，以评价其安全性，为临床用药方案的制定和新兽药的申报及生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和药物 1日龄健康三黄鸡150只，雌雄各半，购自广西金陵农牧集团有限公司，饲喂未添加任何抗生素的常规饲料，自由采食，自由饮水，饲喂至15日龄备用。柴桂感寒口服液，河南牧翔动物药业有限公司研制，规格为1.44 g/mL，即每1 mL柴桂感寒口服液相当于原生药1.44 g，100 mL/瓶，批号20170301，经河南省兽药监察所检验符合规定。

1.1.2 主要试剂 普康血细胞分析仪应用试剂，深圳普康公司产品；血清生化指标测定试剂盒、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、总蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、血糖、总胆红素、总胆固醇等试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 主要仪器 普康PE-6100全自动血球计数仪，深圳普康公司产品；全自动生化分析仪(日立-7180)，日本日立公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 选取15日龄的健康三黄鸡150只，随机分为5组，每组30只，设置空白对照组、4个药物剂量组即柴桂感口服液临床推荐剂量(每1 L水，鸡，1 mL)的1、3、5、10倍量，各试验组鸡分别给予不同剂量的柴桂感口服液，空白对照组给予饮用水，连续用药5 d，停药后继续观察至第14天，记录鸡的临床表现，具体见表1。

表1 试验动物分组和处理

1.2.2 临床体征观察 试验期间观察试验鸡是否出现与药物相关的不良反应，如呼吸、行为异常、精神状态和排便等变化情况；记录试验鸡的异常表现，如过敏反应、流涎等出现的时间、程度、持续时间。

1.2.3 体重测定 分别于用药前、试验结束时对试验鸡进行逐只空腹称重，计算各组试验鸡的平均增重和增重率。

平均增重(g)=试验结束时组平均体重-用药前组平均体重；

增重率(%)=(平均增重(g)/用药前组平均体重)×100%

1.2.4 样品采集及前处理 分别在给药后第7天、给药后第14天对试验鸡进行采血。每组分别随机抽取15只鸡，于翼静脉采血2 mL，分两管放置(其中一管加抗凝剂)，分别用于血常规分析及血液生化指标分析。

1.2.5 血常规分析 取抗凝全血用普康PE-6100全自动血球计数仪进行白细胞、红细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、中间细胞和血红蛋白等指标计数分析。

1.2.6 血液生化指标分析 取血清分别用试剂盒进行丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、总蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、血糖、总胆红素、总胆固醇等指标分析。

1.2.7 脏器指数和病理学检查 试验结束时，每组抽取15只试验鸡进行称重，放血处死，进行病理解剖学检查，重点观察肺、肝、肾等有无肉眼可见的病理变化；摘取肝、肾、脾、肺和法氏囊等脏器进行称重，计算脏器指数；根据解剖学检查决定是否对其进行进一步组织病理学检查。

脏器指数(mg/g)=脏器重量/体重

1.2.8 数据处理分析 数据采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，组间数据差异性采用单因素方差分析，结果用平均值±标准差(Means±SD)表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 临床体征变化

按不同剂量给药后，各试验剂量组雏鸡进食均正常，运动、呼吸和排泄均未见异常，未见不良反应，无死亡情况。

2.2 体重变化

由表2可知，各试验剂量组鸡的平均增重均高于空白对照组。与空白对照组相比，1倍剂量组平均增重显著高于空白对照组(P<0.05)，3倍剂量组、5倍剂量组、10倍剂量组平均增重均极显著高于空白对照组(P<0.01)；各剂量组与空白对照组相比增重率均明显上升，其中5倍剂量组的增重率高达189.85%。

表2 不同剂量的柴桂感寒口服液对鸡体重变化的影响

2.3 血常规指标测定结果

由表 3和表4可知，给药后第7天，1、3、5、10倍剂量组的血常规各项指标数值与空白对照组相比，差异均不显著(P>0.05)。给药后第14天，5倍剂量组的白细胞数显著高于空白对照组(P<0.05)；3、5、10倍剂量试验组淋巴细胞数极显著高于空白对照组(P<0.01)；10倍剂量试验组红细胞数显著高于空白对照组(P<0.05)；3和5倍剂量试验组血红蛋白含量显著高于空白对照组(P<0.05)，10倍剂量试验组血红蛋白含量极显著高于空白对照组(P<0.01)。

表3 不同剂量的柴桂感寒口服液对鸡血常规指标的影响(第7天)

表4 不同剂量的柴桂感寒口服液对血常规指标的影响(第14天)

2.4 血液生化指标检测结果

由表5可知，给药后7 d，各试验剂量组与空白对照组相比，血液生化指标均无显著性差异(P>0.05)。由表6可知，给药后14 d，5倍剂量组的碱性磷酸酶含量显著低于空白对照组(P<0.05)，3倍剂量组的白蛋白的含量显著高于空白对照组(P<0.05)，5倍剂量组和10倍剂量组的白蛋白含量极显著高于空白对照组(P<0.01)，10倍剂量组的尿素氮含量显著高于空白对照组(P<0.05)；5倍剂量组和10倍剂量组的总胆固醇含量显著高于空白对照组(P<0.05)。

表5 不同剂量的柴桂感寒口服液对鸡血液生化指标的影响(第7天)

表6 不同剂量的柴桂感寒口服液对鸡血液生化指标的影响(第14天)

2.5 脏器指数

由表7可知，与空白对照组相比，各剂量组的肝脏指数、脾脏指数、肺脏指数、肾脏指数和法氏囊指数均无显著性差异(P>0.05)，且5、10倍剂量组的法氏囊指数高于空白对照组。

表7 不同剂量的柴桂感寒口服液对鸡脏器指数的影响

2.6 剖检及其病理变化

试验至14 d，对各试验组鸡进行剖检及病理组织血检查。结果显示，各脏器表面光滑有弹性，按压有弹性，未见出血及其他异常变化。病理组织学观察见心脏组织结构完整，心肌细胞轮廓清晰，核质分明纤维走向正常；肝脏组织结构完整，肝小叶清晰可辨；脾小叶清晰可辨，周围淋巴细胞密集；肺结构完整，肺泡清晰可见，肺泡壁未见增宽。肾单位结构清晰，肾小管轮廓正常；法氏囊基本结构清晰可辨，淋巴细胞均匀密集分布；胸腺皮质和髓质区结构明显，其间淋巴细胞分布均匀，细胞轮廓清晰(图1)。

3 讨论

在靶动物安全性试验中，临床体征观察是判断药物对靶动物影响的一种手段，血常规和生化指标分析是检测药物对机体是否有损伤，代谢及重要器官功能是否正常的重要手段[4]。本试验于基础饮水中添加不同剂量的柴桂感口服液对靶动物(鸡)进行安全性试验，观察该药物对试验鸡体征及脏器、血液生理学和生化指标的影响。在为期14 d的试验过程中，各剂量试验组与空白对照组相比较，试验组鸡的体重均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的增高，这可能与该制剂组方药中具有清利胆热、清热生津等药效作用有关[2]，从而提高采食量和消化能力并促进雏鸡生长。试验结果说明，柴桂感口服液在推荐剂量10倍以下通过饮水给药，对鸡生长性能无不良影响，且能具有提高试验雏鸡增重率的作用。

血常规的指标是衡量机体状况的重要依据，也是疾病诊断和检测的指标之一[5]，而白细胞及淋巴细胞是主要参与机体免疫反应的两类细胞[6-7]，血红蛋白含量在一定程度上可反映机体携带氧气及是否贫血的指标之一[8]。本试验中，各试验组鸡通过饮水给药后第7天，其血常规的各项指标数值与空白对照组相比，差异均不显著(P>0.05)；给药后第14天，5倍剂量试验组的白细胞数显著高于空白对照组(P<0.05)，3、5和10倍剂量试验组的淋巴细胞数极显著高于空白对照组(P<0.01)；10倍剂量试验组的红细胞数显著高于空白对照组(P<0.05)，3、5和10倍剂量试验组的血红蛋白含量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于空白对照组，但上述指标均在正常生理值范围。结果表明，柴桂感口服液在推荐剂量10倍以下通过饮水给药不影响动物机体的正常机能状态。而红细胞及其血红蛋白是运输O2和CO2的载体，也参与机体的免疫调节作用，在本实验中，白细胞数、淋巴细胞数、红细胞和血红蛋白值等指标升高反映了柴桂感口服液可能具有增强试验雏鸡免疫调节的作用。

A～G.空白对照组的心、肝、脾、肺、肾、法氏囊及胸腺；A′～G′.10倍剂量组的心、肝、脾、肺、肾、法氏囊及胸腺

血液生化指标主要检验机体的生理及代谢状况和重要器官的功能状态[9]，白蛋白是主要参与运输、合成等功能的一类蛋白质[10]。给药后7 d，各试验剂量组与空白对照组相比，血液生化指标均无显著性差异(P>0.05)，试验第14天，5倍和10倍剂量试验组的白蛋白含量极显著高于空白对照组(P<0.01)，3倍剂量组显著高于空白对照组(P<0.05)，说明柴桂感寒口服液不影响机体代谢状态，而给药一定时间后，还具有促进代谢合成的作用。因此，柴桂感寒口服液可能具有增强雏鸡机体代谢而促进生长的作用。5倍剂量组的碱性磷酸酶含量显著低于空白对照组(P<0.05)，据文献所述碱性磷酸酶[11]升高预示有肝损伤发生，那么降低则意味着有保肝作用；尿素氮是评价肾脏功能状况的指标之一[12]。试验第14天，10倍剂量组的尿素氮水平极显著高于空白对照组(P<0.01)，但在正常生理值范围，而尿素氮水平的升高可能预示着肾功能活跃；丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶和总胆固醇是指示肝功能状态的指标[13]，其中主要以丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶为主。本试验中，各剂量试验组鸡的丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶与空白对照组比较均差异不显著， 10倍剂量组的总胆固醇显著高于空白对照组(P<0.05)，但仍在正常范围内。结果表明，柴桂感寒口服液对试验鸡的肾脏和肝脏的功能无不良影响。

柴桂感寒口服液在临床推荐剂量的1倍～10倍剂量范围内对靶动物(鸡)饮水给药，未表现毒性反应，临床用药是安全的，无毒副作用。