伪结核棒状杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

刘 刚，尹 峥，李晨露，徐海玲，王晶晶，张 琪，许信刚，杨增岐

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

羊干酪性淋巴结炎(Caseous lymphadenitis,CLA)又称羊伪结核病，是一种以伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis，Cp)为病原的慢性传染病，该病的主要特征是在体表淋巴结部位和内脏出现广泛脓肿，病羊迅速消瘦，肉用价值和产奶量下降，严重者甚至会死亡[1]。该病在奶山羊上的临床表现形式主要有体表型和内脏型，也有体表和内脏混合出现的混合型，体表型主要在体表淋巴结，如下颌淋巴结、腮腺淋巴结、颈浅淋巴结、腋下淋巴结等部位形成脓包。内脏型主要是在屠宰过程中发现在内脏(最常见于肺和纵隔淋巴结)形成脓肿且伴随严重的渐行性消瘦，内脏型一般在体表无脓胞症状。也有体表型和内脏型共存的羊只，即混合型。由于患病羊只脓肿外部破裂病原体被释放，破溃的脓肿能够向外界释放大量的活菌，从而造成外界环境污染[2]。细菌通过皮肤伤口和擦伤感染，感染后无论是游离的还是吞噬细胞吞噬的细菌，都会引流进入局部淋巴结引起健康羊只形成脓肿。近年来，中国陕西、贵州、云南、四川等地相继暴发该病[3-6]，羊毛、肉类和奶产量减少，CLA对绵羊和山羊产业产生了严重的经济影响。抗生素对本病的治疗效果不明显，因为活菌在脓肿内受到保护，脓肿周围有厚厚的包膜[7-9]。

目前，CLA的诊断主要是根据其临床特征和脓肿脓液中Cp的检测，需要分离病原菌，且主要针对体表型患病羊只，在实际临床中诊断意义不大[10]。CLA血清学诊断方法主要有菌体凝集抑制试、免疫扩散试验、间接血凝试验、ELISA方法，菌体凝集抑制试验特异性和灵敏度较差，不利于大规模临床应用，间接红细胞凝集试验抗原制备步骤繁琐、结果判定容易有主观误差。ELISA方法中，常用不同的细菌成分用作固相抗原，如细胞壁抗原、外毒素、重组外毒素等，然而到目前为止，还没有一种方法能够将简单的抗原制备过程与ELISA的特异性优势结合起来。因此，本研究的目的是建立一种易于制备的固相抗原的ELISA方法，该方法适用于筛选大量特异性和敏感性高的血清，从而能够识别阳性群体和潜在感染个体，对伪结核抗体检测及血清学调查具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和血清 Cp陕西分离株分离鉴定并保存于西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室[11]。CLA阳性血清选用体格健康无病的奶山羊，每周用Cp菌株接种注射1次，出现注射部位肿胀化脓不予治疗，注射2次，在第3周采血并分离的血清即为阳性血清。CLA阴性血清为采自无山羊伪结核病羊场的健康新生羔羊血清。羊布鲁氏菌阳性血清、羊产气荚膜梭菌阳性血清、羊结核阳性血清、羊流产衣原体阳性血清、羊小反刍兽疫阳性血清均由本实验室保存的试剂盒中的标准阳性血清。423份待检血清随机采自陕西省部分地区不同规模化奶山羊养殖场。

1.1.2 主要试剂 96孔酶标板，赛默飞科技公司产品；HRP标记兔抗山羊IgG，上海翊圣生物科技公司产品；BSA，Solarbio公司产品；TMB显色液，TIANGEN生化科技有限公司产品；Tween-20，天津致远化学试剂有限公司产品;LB培养基，北京索莱宝科技有限公司产品；肉汤培养基，北京奥博星生物技术有限公司产品； 犊牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 全自动酶标分析仪(AMR-100)，杭州奥盛公司产品；高速离心机(H1650-W)，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；电热恒温培养箱(DNP-9162)，上海精宏实验设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 ELISA包被抗原的制备 将分离鉴定后甘油保菌的Cp菌种接种于50 mL/L犊牛血清营养肉汤培养基中，恒温振荡器220 r/min、37℃的条件下培养24 h后，传代培养接种于10 mL 50 mL/L犊牛血清营养肉汤培养基中继续培养48 h。3 500 r/min离心5 min，倒掉上清液保留菌体，用PBS重悬菌体后离心洗涤菌体3次，即为所需抗原。经70℃水浴热灭活1 h后4℃保存。

1.2.2 抗原最佳包被浓度及抗体最适稀释倍数确定 对灭活后的菌体沉淀，用 0.05 mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液重悬做5个浓度的稀释，在分光光度计下调整使其OD600 nm值分别为0.243、0.141、0.084、0.055、0.017，包被酶标板，100 μL/孔；将伪结核病阳性血清和阴性血清分别用抗体稀释液倍比稀释(体积比分别为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)后加入酶标板，100 μL/孔；按常规间接ELISA法操作，以按照参考文献[12]的方阵法进行试验，选择抗原最佳包被浓度和抗体最适稀释倍数。

1.2.3 酶标记二抗最佳工作浓度的确定 包被用抗原、标准血清以及酶标二抗进行正交试验，酶标二抗稀释成2个浓度梯度(1∶2 500和1∶5 000)，同时设立空白对照，按步骤进行操作分析数据来测定最佳酶标二抗的工作浓度。按ELISA操作步骤进行试验，对所得数据进行分析。以阳性样品OD450 nm值(P值)在1.0左右，阴性样品OD450 nm值(N值)在最接近本底值0.04处，且P/N最大时，为最佳血清稀释浓度。

1.2.4 封闭时间的优化 在以上最佳条件筛选的基础上，加入封闭液，设置3个封闭时间，分别为60、90、120 min，其他步骤同以上步骤，设3个重复，测定OD450 nm值，根据P/N确定最佳封闭时间。

1.2.5 最佳封闭液确定 分别选择50 g/L脱脂奶粉、50 mL/L牛血清、10 g/L BSA和50 mL/L山羊血清作为封闭液，封闭2 h，用阴、阳性血清进行ELISA试验，设3个重复，测定OD450 nm值，根据P/N确定最佳封闭时间，选择最佳封闭液。

1.2.7 特异性试验 利用建立的间接ELISA方法检测羊布鲁氏菌阳性血清、羊产气荚膜梭菌阳性血清、羊结核阳性血清、羊流产衣原体阳性血清、羊小反刍兽疫阳性血清样品进行检测，每个样品3次重复，同时设立伪结核病阳性标准血清、阴性标准血清和空白对照，评估该方法的特异性。

1.2.8 敏感性试验 将伪结核病阳性血清分别做1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560倍稀释，进行ELISA试验检测，评价该方法的敏感性。

1.2.9 重复性试验 按照参考文献[13]方法，用以上建立的间接ELISA方法对伪结核病强阳性、阳性、弱阳性和阴性羊血清各2份，每份样品做3孔重复，测其OD450 nm值，进行批内重复性试验。分别用3次制备的全菌抗原包被酶标板，对上述血清样品进行3次ELISA检测，每份样品重复3孔，测其OD450 nm值，进行批间重复性试验。

1.2.10 临床样本检测 目前国内尚无商品化试剂盒，因此选用10份经细菌分离鉴定伪结核阳性的山羊血清样品，按照本试验确定的最佳条件，设置健康山羊，伪结核病阳性血清、伪结核病阴性血清对照，并做空白对照，进行ELISA试验，统计并分析试验结果。并且用已建立的ELISA抗体检测方法对陕西省不同地区规模化奶山羊养羊场采集的423份血清样品进行检测。

2 结果

2.1 抗原、抗体及酶标记二抗最佳工作浓度优化结果

ELISA条件优化，结果如表1所示。当包被菌体抗原OD600 nm值为0.084，血清1∶400稀释37℃孵育1 h，二抗1∶5 000稀释37℃孵育1 h，此时P/N值最大(4.648)，阳性血清OD450 nm值接近1(1.004)。因此，选择的抗原最佳包被浓度为OD600 nm值为0.084，血清最适稀释倍数为1∶400，酶标二抗的最佳工作浓度1∶5 000。

表1 菌体抗原浓度及血清和酶标二抗最佳稀释浓度的确定

2.2 封闭条件优化

结果如表2所示。当封闭液选择10 g/L BSA，P/N值(4.640)最大且阳性血清OD450 nm≥1.0。

表2 封闭液的确定

2.3 封闭时间优化

结果如表3所示。封闭时间不同时，阳性血清与阴性血清比值有差异，说明封闭时间对血清测定值有影响；封闭时间为2 h时，阳性血清测定值接近于1.0，阴性血清测定值、空白对照值最接近本底值(0.04)。因此，确定封闭时间为2 h。

表3 封闭时间的确定

2.4 阴/阳性标准临界值的确定

表4 阴性/阳性标准临界值的确定

2.5 特异性试验结果

利用建立的间接ELISA方法检测伪结核病阳性血清、伪结核病阴性血清、羊巴氏杆菌阳性血清、羊布鲁氏菌阳性血清、羊梭菌阳性血清、羊结核阳性血清、羊流产衣原体阳性血清、羊小反刍兽疫阳性血清和空白对照，结果见图1，仅伪结核病阳性血清呈阳性，其余均为阴性，表明该方法特异性较强。

2.6 敏感性试验结果

将伪结核病阳性血清做梯度稀释后，按照上述优化的最佳工作条件，测定其OD450 nm值，测定结果见图2。结果显示，当伪结核病阳性血清稀释度为1∶1 280时其OD450 nm的测定值在0.352之上。表明本研究所建立的ELISA检测方法敏感性可达到1∶1 280，具有良好的敏感性。

A.CLA+;B.CLA-;C.羊巴氏杆菌;D.羊布鲁氏菌;E.羊梭菌;F.羊结核;G.羊小反刍兽疫病毒;H.羊流产衣原体;I.空白

图2 敏感性试验结果

2.7 重复性试验结果

结果如表5 所示，8份血清样品重复性试验结果表明，批内OD450 nm值变异系数在3.9%～8.6%，批间OD450 nm值变异系数在1.9%～8.7%，均小于10%，说明建立的间接ELISA重复性良好。

表5 重复性试验结果

2.8 临床样品检测

临床样品检测结果见表6所示，10份经分离鉴定阳性的病羊只血清样品的检测值均大于0.352，为阳性。健康羊只测值均小于0.352，与羊只实际患病情况一致。说明该检测方法可有效检出患病羊只。对423份血清样品检测结果见表7显示，阳性样本146份，阳性率35%。

表6 临床样品检测结果

表7 3个羊场样品检测结果

3 讨论

目前，对于患病羊只的检测方法主要包括病原检测和血清抗体检测，有明显临床症状的体表型的患病羊只，采集病料后分离病原菌即可确诊该病。但对于内脏型患病羊只，只有在屠宰后才能发现内脏的干酪样化脓灶，因而给病原学诊断带来很大困难。国内尚无安全有效的疫苗用于伪结核病的预防，因此筛查和清除伪结核棒状杆菌持续感染的羊是控制本病传播流行的重要措施。CLA抗体的存在不仅可作为羊群近期感染CLA的证据以及判定感染状况的依据，也可作为筛查和清除CLA持续感羊的辅助手段[13]。

本试验通过热灭活的菌体作为抗原，用常规方法进行条件优化发现，当抗原包被量为OD600 nm值为0.084的菌悬液100 μL/孔，血清以1∶400稀释，以10 g/L BSA封闭2 h，二抗以1∶5 000稀释时条件最佳，并进行验证试验，在此基础上建立了检测CLA抗体的间接ELISA法。采用灭活全菌作为包被抗原，其优势在于包被抗原制备过程简单，成本不高，适用于基层单位检测，只需将培养的菌液离心灭活调整浓度即得，且包被抗原稳定易保藏，冷冻保藏期可达半年以上。而利用重组蛋白作为包被抗原，所需重组蛋白的表达、纯化等过程复杂。另外，全菌作为包被抗原在理论上存在特异性差和非特异性结合增多的缺点，但本研究特异性试验结果表明，该方法与伪结核病阳性血清、伪结核病阴性血清及其他6种常见细菌和病毒阳性血清无交叉反应，批间、批内试验变异系数小，重复性较好；与经细菌分离鉴定确定为伪结核阳性的血清反应，其OD450 nm值均高于临界值0.325，特异性良好，可用于临床检测。重复性试验和敏感性试验表明，本方法重复性好，敏感性强，临床样品检测阳性符合率高。

使用优化建立的间接ELISA方法对部分奶山羊养殖场423份血清样本进行检测，发现羊场Cp抗体阳性率为35%，表明目前CLA在羊场感染情况较严重。应用试剂盒对羊群进行抗体筛查使得真正的阴性动物可以留在畜群中，不会有病原菌持续存在和扩散的风险，大多数阳性感染动物会被淘汰或从群核心中分离出来，直到随后的筛选或扑杀进而实现控制、净化和根除本病的目的。