免疫压力下口蹄疫病毒的抗原变异

杨金平，郑海学，朱紫祥

（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原学国家重点实验室 口蹄疫国家参考实验室，兰州 730046）

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的急性、热性、高度接触性传染病，主要感染猪、牛、羊等偶蹄类动物，使动物发病甚至死亡[1]。FMDV为小RNA病毒科口蹄疫病毒属的单股正链RNA病毒，FMDV有7个血清型，分别为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1[2]，不同血清型之间无交叉保护作用，部分血清型病毒又分为不同的亚型，而不同亚型间也具有交叉保护力低的特点[3]，这给FMD的防控带来了很大的困难。

作为RNA病毒的一员，FMDV在复制的过程中极易发生抗原变异[4-5]。并且在免疫压力之下，这种突变频率会增加[6]。开展FMDV遗传变异的研究至关重要，因为编码衣壳蛋白的基因的改变会导致抗原变异，从而影响疫苗的免疫效能[7]。这种变异导致宿主免疫系统不能有效的清除病毒，即病毒抗原变异能够使病毒逃避宿主免疫应答反应，从而实现持续感染[8]。本文主要对免疫压力下FMDV抗原变异的相关研究进展进行综述，为进一步开展FMDV抗原变异与致病机理研究及FMD防控策略的制定提供参考。

1 FMDV粒子及病毒基因组结构

FMDV粒子呈球形，直径约25～30 nm，由衣壳和基因组RNA组成。其基因组长度约8.5 kb，被一个二十面体衣壳包裹。病毒衣壳由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白组成，其中，FMDV的抗原位点主要位于衣壳蛋白上，VP1、VP2、VP3位于衣壳的表面且三者结构相似，VP4位于衣壳的内部[9]。病毒结构蛋白形成二十面体对称结构，在这些结构蛋白中，VP1最易发生变异，也是决定病毒抗原性的主要成分[10-11]，且VP1蛋白表面有一个βG-βH环序列，该环从病毒体表面延伸并形成重要的抗原位点，并且还包含高度保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序[12]，该基序通过与细胞内受体结合来介导FMDV的吸附和入侵，也是抗原发生变异的主要位点[13-15]，而VP4蛋白最保守。衣壳包裹着8.5 kb的单股正链RNA基因组，该基因组RNA主要由5'和3'非编码区、poly（A）尾和一个长约7000 nt的开放阅读框（open reading frame，ORF）组成。5'非编码区长度约为1300 nt[1]，由5'端的S片段、多聚C区、一系列RNA假结节结构、顺式作用复制元件（cis-acting element，cre）和内部核糖体进入位点（IRES）组成。开放阅读框编码一个大的多聚蛋白，然后被病毒蛋白酶切割裂解后形成四种不同的结构蛋白和十一种不同的非结构蛋白[16]，主要由L区（编码Lpro）、P1区、P2区和P3区组成（图1）。前导蛋白（Lpro）是位于基因组的N末端，L编码区包含两个独立的起始密码子，产生两种不同的L蛋白，分别称为Lab和Lb。P1区域编码病毒的四种结构蛋白，包括VP1、VP2、VP3和VP4，各有60个分子组成。P2和P3区域主要编码病毒的非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B（3B1、3B2和3B3）、3Cpro和3Dpol，这些非结构蛋白主要参与病毒的复制和调节宿主细胞对感染的反应[17]。3'非编码区比5'非编码区较短，大约有90个核苷酸，折叠形成一个特定的茎环结构，然后是一个的多聚腺苷酸poly（A）尾组成[18]，3'非编码区在病毒基因组复制中发挥了重要的作用。

图1 FMDV粒子及基因组结构Fig.1 The genome structure of FMDV

2 FMDV的抗原位点

FMDV在自然进化中具有很高的变异频率[19]，Fares等[6,20]报道其研究使用的所有变异毒株在单克隆抗体存在情况下，其变异频率会增强。在中和单克隆抗体的压力下选择毒株变异体，并用不同的单克隆抗体进行交叉中和试验，是确定小RNA病毒抗原位点的方法之一[20]。通过单克隆抗体筛选实验，许多实验室已经产生了针对O、A、C和Asia1型FMDV单克隆抗体，并且使用单克隆抗体或合成肽制剂，通过诱导FMDV基因组突变，鉴定出了O型FMDV表面上的多个抗原位点[21-25]，A型FMDV的A10和A12亚型上各鉴定出2个位点[11,26]，C型FMDV的VP1上的主要位点[27-29]，以及Asia1病毒的3个抗原位点和1个参与抗体中和反应的位点[20]。

目前研究最为深入的是O型FMDV的抗原位点（表1），McCullough等[30]通过竞争 ELISA方法对O型FMDV瑞士分离株的抗原位点进行了系统研究，首次证明FMDV颗粒上既存在胰蛋白酶敏感位点，也存在胰蛋白酶抗性中和位点（传染性相关位点），确定了病毒粒子上存在一个或多个抗原表位。研究显示VP1的G-H环内不仅有B细胞的抗原表位，而且具有辅助性T细胞的抗原表位，尽管目前认为对于FMDV的保护性免疫反应主要与抗体水平有关[31]，但是抗体的产生需要T细胞的存在[32-33]。Xie等[21,34-35]通过单克隆抗体诱导毒株突变实验在O型FMDV的VP1、VP2、VP3及VP4蛋白上鉴定出至少存在5个B细胞抗原表位，并且认为这些抗原表位的发现和抗原变异的影响可能与疫苗的选择和病毒进化有关。在这些位点中，位点1是主要的保护性抗原位点，位于VP1蛋白的G-H环上，由VP1的两个表位构成（VP1的141～160和200～213位氨基酸残基），针对上述表位的抗体能够保护动物免受病毒侵袭，其关键氨基酸为144、148、154和208位[36]氨基酸；位点2位于病毒表面VP2的βB-βC环和βE-βB环上（编码VP2 70～78和131～134位氨基酸残基），由4个表位构成，关键氨基酸为70、71、73、75、77和131位氨基酸；位点3位于病毒粒子五重轴周围的βB-βC环上，关键氨基酸位点为43、44位氨基酸[37]；位点4位于五重轴附近VP3的B-B“结节”上（编码VP3的56～58位氨基酸残基，关键位点为58位氨基酸）。位点5位于VP1蛋白G-H环内，关键氨基酸为149位的谷氨酸，其与位点1功能相互独立[23,34,38]。Asfor等[39]通过豚鼠实验发现，有一种FMDV变异体能够逃逸先前发现的5个抗原位点的单克隆抗体中和作用，表明其可能存在第6个抗原位点。作者通过比较牛抗血清与O型FMDV中和的能力，确定了VP2-74、VP2-191和VP3-85位3个新的潜在的抗原位点，使用定点诱变实验检测这些位置对中和反应的影响，发现VP2-191位点突变能影响中和作用效应，可能是潜在的第6个中和抗原位点。这项研究为新的中和抗原表位的存在提供了证据。

目前研究已表明，C型FMDV有4个抗原位点[40]（表1），位点1位于VP1的G-H环上，是C型FMDV的一个主要连续性抗原位点，关键氨基酸主要位于138-150位氨基酸残基，其改变可导致病毒抗原性的明显改变。位点2为一个独立的抗原位点位于衣壳的五重轴附近，主要由VP1的B-C环（43-48位氨基酸）和VP1的H-I环（170位氨基酸附近）构成。位点3位于VP1的C末端（约15个氨基酸残基），是一个独立的连续性位点。位点4位于衣壳三重轴附近的一个不连续的抗原区，是C型FMDV的一个主要抗原位点，包括VP2的B-C环（70～80位氨基酸）和VP3的B-B结（58～61位氨基酸），VP1的C末端的一部分也参与位点4的构成。Butchaiah等[20,41]用交叉单克隆抗体中和实验结果筛选确定Asia1 FMDV存在至少4个抗原位点（表1），其中位点1在14S、12S抗原和VP1上，是非构象依赖性的；位点2和位点3均存在于完整的病毒粒子140S上，其中位点3的单克隆抗体能够中和所测试的十种不同的Asia1病毒分离株的感染，表明该位点在Asia1病毒血清型中是比较保守的，是构象依赖性的；位点4位于病毒粒子的16S和12S蛋白亚基上，是非构象依赖性表位[20]。

表1 O、C和Asia1型FMDV抗原位点Table 1 Antigenic sites of serotype O,C and Asia1 FMDV

A型口蹄疫抗原位点也有相关研究，但是A型FMDV抗原表位的数量和定位比较复杂（表2）。对A型FMDV抗原结构的研究主要集中在A5、A10、A12、A22等亚型中。Robertson等[43]报道FMDV A12亚型具有包括VP1、VP2为主的3个抗原位点，但1989年Baxt[26]报道FMDV A12只有1个主要抗原位点和1个次要抗原位点，主要抗原位点是一个免疫优势抗原位点，其内至少存在4个表位，包括了VP1的3个表位和VP3上的第4个表位；次要抗原位点内只发现1个表位，位于VP1上。1989年Thomas等[11]发现FMDV A10有2个主要抗原位点和2个次要抗原位点，两个主要抗原位点中一个是胰酶敏感的，包括VP1的140～160序列。另外一个主要位点是非胰酶敏感的，包括VP3上的部分残基，两个次要位点分别位于接近VP1的169位和VP1的C末端。1989年Bolwell等[44]报道FMDV A22 Irag24/64株有两个抗原位点，其主要抗原位点至少由3个重叠的线性表位构成，其位置分别在VP1序列145～154、147～154、137～152位氨基酸，另外一个抗原位点由构象表位构成，但其位置并不清楚。1991年Saiz等[45]用单克隆抗体筛选发现SP-86毒株A5亚型有2个中和抗原位点均位于病毒表面，第一个位于VP1 C末端的第198位氨基酸，是一个线性表位；另一个位点在VP2上，由2个构象表位组成，关键氨基酸是VP2蛋白的第72和79位氨基酸。

表2 A型FMDV抗原位点Table 2 Antigenic sites of serotype A FMDV

3 免疫压力下FMDV的抗原变异

作为RNA病毒的一员，FMDV具有明显的抗原变异性[19,48]。Domingo等[5,49-50]认为FMDV病毒种群是由“突变谱”而不是由一种特定的基因组序列组成的，称之为“准种”，并且通过大量研究提出在感染的培养细胞或动物体内存在一个含有主要序列的准种和围绕其周围的大量不同的FMDV亚型，他们共同构成了一个毒株，在动物免疫选择压下抗原性朝向有利于逃避机体免疫应答的序列方向改变，形成新的FMDV变异株，从而形成新的病毒群体[50]。RNA病毒的突变频率比宿主高100万倍，这种高的突变频率被认为与病毒毒力和进化有关，对病毒本身是有益的。其中核苷酸的每个位点每次复制时的平均突变率为4×10-4至4×10-2[51]，这种变异有10-2～10-3次发生在VP1蛋白中[52-53]。Haydon等[7]研究表明编码衣壳蛋白的基因改变会导致抗原变异发生，并影响疫苗的保护作用，并且认为其基因变异可能对病毒在国家、地区、畜群甚至可能是个体之间的传播有着重要的意义。

Biswal等[54]在自然条件下暴发FMD后，对持续性感染的牛和水牛中进行连续13个月的采样，将采集样品中分离的O/ME-SA/Ind2001d亚系FMDV的遗传和抗原变异进行了纵向分析。结果发现，在2014年5月和2014年11月采集的持续性感染样品中病毒的序列间，以及2014年5月到2014年8月采集的病毒序列间最大核苷酸差异达到2.4%。该研究还指出，在病毒持续感染动物期间，病毒分离株与疫苗株的抗原关系有趋于降低的趋势，这表明动物携带的病毒有出现不同的病毒株的可能性。同时，研究发现在持续感染的动物体内FMDV VP1基因的变异频率要比正常情况下快10倍以上，表明FMDV基因组在持续感染期间并且在较高的选择压力下，容易发生抗原变异，该变异在不同的宿主体内可能产生不同的影响，有助于病毒在不同的宿主体内的进化[54]。

阿根廷于1997年根除FMDV后，在2000年到2002年再一次遭受FMDV大流行，Brito等[55]对2000-2002年在阿根廷流行的FMDV毒株进行了全基因组测序分析，发现在2000年疫情暴发的病毒与2001年疫情期间发现的病毒毒株有所不同，表明病毒基因组具有时间多样性，并且与流行期间病毒暴发的次数有关。Perez等[56]对2001年1月～12月阿根廷暴发的A型FMDV VP1蛋白基因核苷酸差异进行了分析，发现各毒株之间核苷酸的差异随着毒株流行地点之间距离、发病率，以及FMDV暴发持续时间的增加而增加。Sarangi等[57]对疫苗血清抗体的体外培养下，O型FMDV血清中的抗原位点的变化进行研究，发现在疫苗免疫产生亚中和水平的牛血清存在下，从BHK-21细胞中连续繁殖分离出的3种FMDV O型毒株（INDR2/1975、IND120/2002和IND271/2001）中，在FMDV关键抗原位点VP1的144位、45和48位，VP2的72和134位发现了氨基酸的突变。同时在FMDV抗原位点附近的一些氨基酸也发生了突变，如VP1蛋白的第41和51位（B-C环）、133、140和143位（G-H环）、201、204和209位（C端)）氨基酸，VP3的71和75位（B-C环)、131位（E-B区)、174和179（G-H环）及219位氨基酸（C末端）都出现了突变。而且这些抗原位点及周边位点的变异在病毒逃避中和作用方面有重要的意义。因此，FMDV抗原变异是在宿主免疫压力下直接选择的结果，抗原的变异是体内免疫系统直接选择的结果。

4 小结

抗原变异是免疫压力选择的结果，使FMDV在宿主体内朝着有利于自身存活及持续增殖方向的发展。世界各国当下已经研发了多种有效控制口蹄疫流行的灭活疫苗，但是在疫苗接种的压力下病毒进化的频率也不断加快，从而持续引发新的抗原变异，疫苗的保护能力出现下降，影响口蹄疫疫苗免疫效果。Pandey等[58]研究证明，除了免疫压力选择外的其他压力也可以使抗原发生变异。而当抗原突变积累到一定程度时，往往会造成新的毒株的出现，给口蹄疫的防控带来的更大的困难，这也是口蹄疫呈现周期性流行的主要原因。研究FMDV抗原变异对实际生产具有重要的指导意义，对口蹄疫的防控也有着至关重要的意义。