超高效液相色谱-三重四极杆飞行时间质谱法鉴定地锦草化学成分及超高效液相色谱法建立地锦草指纹图谱

2021-08-29冯光维黄春丽许义红魏学军韩忠耀

理化检验-化学分册 2021年8期

冯光维,黄春丽,许义红,龚元,魏学军,韩忠耀

(黔南民族医学高等专科学校,都匀 558000)

地锦草为大戟科植物斑地锦或地锦的干燥全草[1-2]。«中国植物志»中记载地锦草的来源包含土库曼大戟、小叶地锦、新竹地锦、地锦、斑地锦、小叶大戟、匍匐大戟、匍根大戟、台西地锦、千根草等。地锦草的广泛来源,加大了该药材质量控制的难度,也体现了该药材质量评价研究的重要性。据报道,地锦草中的化学成分种类丰富[3-5],富含没食子酸、槲皮素[6-8]、黄酮类化合物[9]等,因此以一个或几个指标性化学成分对地锦草进行药材质量控制与评价不全面,不能客观地反映药材的整体质量。

超高效液相色谱-三重四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS)技术可实现对中药、民族药化学成分的快速分析,同时指纹图谱技术能够更加全面地反映药材的内在整体化学成分类型,并且可应用于中药、民族药的质量评价[10-12]。目前,有关地锦草指纹图谱的相关报道多采用高效液相色谱法(HPLC)建立指纹图谱[13-15]。而超高效液相色谱法(UHPLC)在HPLC 基础上以分离度高、分析时间短、高效等特点更具有推广应用的优势[16-17]。查阅相关文献发现,有关不同产地的地锦草的UHPLC指纹图谱以及采用UHPLC-Q-TOF-MS技术快速分析其化学成分的研究尚未见报道。

本工作以不同产地的12批地锦草为研究对象,采用UHPLC-Q-TOF-MS技术指征其化学成分,建立了不同产地的12批地锦草的UHPLC指纹图谱,提高了分析效率,为地锦草质量控制研究及临床用药提供了参考与试验依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity UPLC 型超高效液相色谱仪;LC-30AD 型超高效液相色谱-Triple TOF 4600 型高分辨串联质谱仪;Sorvall ST16R 型离心机;Milli-Q 型超纯水机;KQ-300B 型超声清洗仪;FW177型高速粉碎机;Mettler Toledo XP205型电子天平;FA124型电子天平。

混合标准储备溶液:称取适量的没食子酸、槲皮素、木犀草素、芹菜素、山奈酚、鞣花酸标准品,加入适量甲醇,超声(频率40 k Hz,功率300 W)处理2 min,溶解后,用甲醇定容至25 mL 容量瓶中,配制成含291.20 mg·L－1没食子酸、208.40 mg·L－1槲皮素、88.00 mg·L－1木犀草素、86.80 mg·L－1芹菜素、89.20 mg·L－1山奈酚、308.00 mg·L－1鞣花酸的混合标准储备溶液。

混合标准溶液:移取上述混合标准储备溶液1mL,置于10mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,配制成含29.12mg·L－1没食子酸、20.84mg·L－1槲皮素、8.80mg·L－1木犀草素、8.68mg·L－1芹菜素、8.92mg·L－1山奈酚、30.80mg·L－1鞣花酸的混合标准溶液,避光保存。

没食子酸、槲皮素、鞣花酸、山奈酚、芹菜素、木屑草素标准品的纯度均不小于98%;甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯;其他试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

12批(S1～S12)地锦草样本购自不同产地,经鉴定为大戟科植物地锦的干燥全草。其中,S1～S3批次产地为贵州省松桃县;S4～S6批次产地为河南省安阳县;S7～S9批次产地为安徽省亳州市;S10～S12批次产地为广西兴安县。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 UHPLC-Q-TOF-MS检测条件

1)色谱条件参照文献[18-20]分析条件并进行优化。Acquity HPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);二极管阵列检测器(DAD),检测波长254 nm;流量0.3 mL·min－1;柱温30 ℃;进样量2μL;流动相A 为0.1%(体积分数)甲酸溶液,B 为乙腈。梯度洗脱程序:0～0.50 min时,B 为10%;0.50～7.00 min 时,B 由10%升至85%,保持4.00 min;11.00～11.50 min时,B由85%降至10%,保持3.50 min。

2)质谱条件电喷雾离子源(ESI),正、负离子(ESI＋,ESI－)模式;质量扫描范围为质荷比(m/z)50～1 000;干燥气压力379 k Pa,辅助气压力379 k Pa,气帘气压力172 k Pa;雾化温度600 ℃;采用飞行时间串联质谱碎片离子关联采集(TOF-MSProduct Ion-IDA)扫描模式,TOF-MS一级预扫描和触发的二级扫描Product Ion-IDA 离子累积时间分别为250,100 ms;采用多重质量亏损(MMDF)和动态背景扣除(DBS)作为二级触发条件,解簇电压80 V,碰撞能量为45 eV 或－30 eV,碰撞能量叠加为±15 e V。

1.2.2 UHPLC指纹图谱条件

同1.2.1节色谱条件,梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

1.3 试验方法

将地锦草用粉碎机打碎后,过三号筛(50目,孔径0.300 mm),称取约2.0 g样品于具塞锥形瓶中,加入50 mL 80%(体积分数,下同)甲醇溶液,密塞,称重,超声(频率40 k Hz,功率300 W)处理45 min后,放冷,称重,用80%甲醇溶液补足减失的质量,摇匀,用定性滤纸过滤。滤液以转速12 000 r·min－1离心10 min,经0.22μm 微孔滤膜过滤,制得供试品溶液,按照仪器工作条件进行检测。

2 结果与讨论

2.1 UHPLC-Q-TOF-MS定性方法的精密度、重复性和稳定性试验

取S2样品1份,按试验方法和仪器工作条件进样检测,连续进样6次,以鞣花酸峰为参比峰,记录16个共有峰的相对保留时间,并计算相对保留时间的相对标准偏差(RSD)。结果表明,RSD 为0.58%～2.0%,说明仪器的精密度良好。

取同一批次S2样品,共6份,按试验方法和仪器工作条件检测,以鞣花酸峰为参比峰,记录16个共有峰的相对保留时间,并计算相对保留时间的RSD。结果表明,RSD 为1.3%～1.9%,说明该方法重复性良好。

取S2样品1份,按试验方法和仪器工作条件,于0,2,4,8,12,24 h分别进样检测,以鞣花酸峰为参比峰,记录16个共有峰的相对保留时间,并计算相对保留时间的RSD。结果表明,RSD 为1.4%～2.4%,说明方法在24 h内可稳定定性。

2.2 地锦草化学成分的鉴定

中药材化学成分复杂,同时由于存在不同种属,造成了其在临床应用中药物开发与质量控制中的困难。多功能串联的高分辨率质谱(HR-MS)为化合物的快速检测和复杂结构的识别提供了工具[21-22]。

由文献[23-25]可知,地锦草化学成分类型基本相似。取地锦草S2 样品,按照试验方法制备供试品溶液,按照仪器工作条件进行检测,得到地锦草的总离子流色谱图见图1,各化学成分鉴定结果见表2。

表2 地锦草中化学成分鉴定结果Tab.2 Identification results of chemical constituents in Euphorbia humifusae Willd.

表2 (续)

图1 地锦草的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of Euphorbia humifusae Willd.

2.3 UHPLC指纹图谱条件的优化

2.3.1 检测波长

以DAD 为检测器,地锦草中没食子酸在270 nm 处有特征紫外吸收,而鞣花酸、槲皮素、山奈酚、芹菜素、木犀草素等成分在254,360 nm 处有紫外吸收。因此,考察了在203,210,230,254,270,345,360 nm 处地锦草的色谱图。结果表明,在检测波长254 nm 处被检出的色谱峰较多,分离相对较好且基线平稳,因此试验选择254 nm 为检测波长。

2.3.2 参照峰

移取混合标准溶液、供试品溶液各2μL,注入UHPLC进行分析检测,记录色谱图,见图2。

由图2可知,鞣花酸峰的保留时间适中,分离度高且峰面积较大。在不同批次的地锦草样品的UHPLC色谱图中得到相同结果。因此,试验选择鞣花酸峰作为参照峰。

2.4 地锦草UHPLC 指纹图谱的建立及相似度评价

取不同产地的12批地锦草样品,按照试验方法进样检测,记录色谱图。将不同产地的12批地锦草的UHPLC谱图以AIA 格式分别依次导入国家药典委员会«中药色谱指纹图谱相似度评价系统»软件(2004 A 版)中,以S1批次样本色谱图作为参照谱进行指纹匹配,以中位数生成对照图谱(R),经过多点校正后自动匹配,建立了地锦草UHPLC 指纹图谱共有模式,见图3。

由图3可知,通过UHPLC技术,建立了不同产地的12批地锦草UHPLC 指纹图谱,获得了16个共有峰[同图2(b)],通过对照品(混合标准溶液)比对指认其中6 个共有峰,分别为峰1(没食子酸)、峰4(鞣花酸)、峰13(槲皮素)、峰14(木犀草素)、峰15(芹菜素)、峰16(山奈酚)。并且,峰1、峰2、峰4、峰7、峰9的峰面积较大,峰13、峰14、峰15、峰16的峰面积较小,其他峰的峰形和相对峰面积比较稳定,体现了地锦草的共同特征。