基于陈皮提取橙皮苷工艺

刘谦鸿，曾柏全

中南林业科技大学生命科学与技术学院（长沙 410000）

橘子树作为中国重要的经济型果树，在中国南部大量种植，2018年全国橘子生产总量为4138.14万 t，每年产生大量橘子皮，但是由于得不到合理利用，大量橘子皮被当作垃圾丢弃，造成巨大浪费和环境污染[1]。近年来欧美国家为提高原料的综合使用，达到缩减成本、提高产品开发价值的目的，从橘子果品中提取功能成分，得到一系列有附加值的产品，其在食品、医药、化工等行业拥有广泛开发价值，具有一定抗癌症效果[2]。在国内，橘皮中的生理活性成分的开发还处在起步阶段。

橙皮苷又名二氢黄酮苷[3]，是橘皮黄酮的重要组成部分，根据国内外文献研究发现橙皮苷具有良好的医药食用价值：（1）通过抑制炎症反应相关的酶来抑制炎症[4]；（2）降低白细胞与血管内皮细胞的粘附与移行，减少崩解后的炎性物质（如组胺、缓激肽、补体、白三烯、前列腺素、过多的自由基等）的释放，从而使毛细血管通透性降低[5]；（3）有效地降低血液黏度，加速血液循环，从而减轻微循环瘀滞[6]；（4）改善淋巴循环，使组织液快速回流，减轻水肿，如地奥斯明（Diosmin）橙皮苷[7]用于痔疮，既可减轻其爆发性症状，也能在发作时间和频率上起到不错效果；（5）具有显著的抗癌、抗氧化、抗菌作用，并且可以保护神经[8]。大部分的中药材的有效成分被包裹在细胞壁内，植物细胞的细胞壁主要成分为纤维素[9]和丰富的果胶[10]，为获取有效成分，必须破坏其细胞壁，才能释放出目标成分，而纤维素酶能够有效地破坏植物细胞壁主要成分纤维素的β-1, 4糖苷键，使纤维素结构破坏[11]，进而提高有效成分的提取收率。使用热回流提取法，选取能溶解橙皮苷的乙醇作为提取剂[12]，通过加热乙醇，将其溶解蒸发，达到提取橙皮苷的目的。

试验从陈皮中提取橙皮苷，使用纤维素酶对陈皮进行预处理[13]，联合使用热回流提取法[14]进行橙皮苷提取，得到一种环境友好型且适合大规模工业生产的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

陈皮购买自湖南亚飞中药饮片有限公司。

橙皮苷标准品（Hesperidin，HPLC，98%，LotNo P06DF77001，上海源叶生物技术有限公司）；纤维素酶粗品（活力单位约1100 U/g，沧州夏盛生物技术有限公司）；其他化学试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 仪器与设备

旋转蒸发仪（R-1001-VN，巩义市中天仪器科技有限公司）；电子天平[BSA223S-CW，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；紫外分光光度计（UV-1700，日本岛津公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线制定

精确称取5 mg（精确到0.0001 g）橙皮苷标准品，用乙醇溶解，定容至50 mL，配制成质量浓度0.1 mg/mL的橙皮苷标准品溶液。

精密吸取橙皮苷标准溶液，以分析纯乙醇为空白对照，用紫外分光光度计在100～500 nm波长扫描，在285 nm处有强吸收峰，确定橙皮苷检测波长285 nm。分别取1，2，3，4和5 mL橙皮苷标准溶液于10 mL容量瓶中，定容，得到质量浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.10 mg/mL的系列溶液，在285 nm波长处检测吸光度，每一浓度测3次，结果取平均值。以橙皮苷标准样品质量浓度（mg/mL）为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程y=29.919x-0.0771，R2=0.999。

1.3.2 橙皮苷提取试验

1.3.2.1 工艺流程与操作

工艺流程：陈皮→粉碎过0.150 mm孔径筛→酶法预处理→加入乙醇→热回流提取→橙皮苷提取液。

操作说明：将陈皮粉碎，过0.150 mm孔径的细筛，在烧杯中进行预处理，分别称取纤维素酶和陈皮粉，按照纤维素酶∶陈皮为1∶30（W/W）比例添加，加入蒸馏水，调节pH 4.8，置于磁力搅拌器上，搅拌预处理1.5 h，在预处理后加入乙醇，分别考察不同乙醇体积分数、时间、料液比对橙皮苷提取率的影响。

1.3.2.2 提取液中橙皮苷含量测定

取提取液稀释至适当浓度，用紫外分光光度计在285 nm处测吸光度，比较吸光度大小，橙皮苷提取率按式（1）计算。

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对橙皮苷提取率的影响

固定温度90 ℃、提取时间4 h、料液比1∶30（g/mL），考察乙醇体积分数对橙皮苷提取率的影响，结果见图1。

根据图1可以看出，在温度90 ℃、提取时间4 h、料液比1∶30（g/mL）条件下，乙醇体积分数从60%提高到75%，橙皮苷提取率显著提高，乙醇体积分数75%时提取率达到最大，而后增加乙醇体积分数，提取率反而降低，可能是高体积分数的乙醇会增加一些醇溶性杂质的溶出量，这些成分与橙皮苷竞争结合乙醇，降低橙皮苷向溶剂的扩散，导致橙皮苷提取率减少，同时会增加成本，因此选择乙醇体积分数70%，75%和80%作为正交试验的3个水平。

图1 乙醇体积分数对橙皮苷提取率的影响

2.2 提取时间对橙皮苷提取率的影响

固定温度90 ℃、乙醇体积分数75%、料液比1∶30（g/mL），考察提取时间对橙皮苷提取率的影响，结果见图2。

根据图2可以看出，在温度90 ℃、乙醇体积分数75%、料液比1∶30（g/mL）的条件下，随着提取时间的延长，提取率逐渐增加，3 h时橙皮苷提取率达到最大值。而后继续增加提取时间，提取率下降，可能是长时间的高温处理会导致橙皮苷结构破坏分解，最终导致提取率的降低，因此选择提取时间2.5，3.0和3.5 h作为正交试验的3个水平。

图2 提取时间对橙皮苷提取率的影响

2.3 料液比对橙皮苷提取率的影响

固定温度90 ℃、乙醇体积分数75%、提取时间3 h，考察料液比对橙皮苷提取率的影响，结果见图3。

根据图3可以看出，在温度90 ℃、乙醇体积分数75%、提取时间3 h的条件下，随着料液比不断减小，橙皮苷提取率上升，料液比1∶20（g/mL）时，橙皮苷提取率达到最大。因为随着料液比减小，乙醇和陈皮之间的接触面变大，增大橙皮苷溶出量。随着溶剂继续增多，生产成本会增加，不利于工业大规模生产，因此选择料液比1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）为正交试验的3个水平。

图3 料液比对橙皮苷提取率的影响

2.4 温度对橙皮苷提取率的影响

固定乙醇体积分数75%、提取时间3 h、料液比1∶20（g/mL），考察提取温度对橙皮苷提取率的影响，结果见图4。

根据图4可以看出，在乙醇体积分数75%、提取时间3 h、料液比1∶20（g/mL）的条件下，随着提取温度的升高，提取率逐渐增加，当温度达到80 ℃时，橙皮苷提取率达到最大值。而后继续升高提取温度，提取率下降，可能是过高的提取温度处理会导致橙皮苷结构破坏分解，最终导致提取率的降低，因此选择提取温度75，80和85 ℃作为正交试验的3个水平。

图4 温度对橙皮苷提取率的影响

2.5 提取橙皮苷的正交试验结果

根据单因素试验，对橙皮苷提取率影响的4个因素（乙醇体积分数、提取时间、料液比、温度）每个因素选取3个水平，选取的水平见表1。固定陈皮粉20 g，其他物料以陈皮粗粉为标准计算，根据L9(34)的正交表安排正交试验，试验结果见表2。

表1 提取橙皮苷试验因素水平选取表

根据表2中的正交试验结果分析极差值，4个因素对橙皮苷提取率影响大小依次为A＞B＞D＞C，其中乙醇体积分数影响力最大，提取时间次之，料液比影响最小，通过考察4个因素在三水平上橙皮苷的提取率，得出最佳反应条件：A1B2C3D3，即乙醇体积分数75%、提取时间3 h、料液比1∶25（g/mL）、温度85 ℃，此时橙皮苷的提取率达到6.04%。

表2 提取橙皮苷试验因素水平表

2.6 验证试验

通过维素酶预处理的单因素试验和正交试验，找到橙皮苷最佳提取条件，在此条件下做验证试验，进行验证分析，固定陈皮粗粉20 g、乙醇体积分数70%、提取时间3 h、料液比1∶25（g/mL）、温度85 ℃，进行3次重复试验，测定橙皮苷的提取率，结果分别为5.98%，5.97%和6.02%，平均提取率为5.99%，与正交试验结果基本一致，且重复性较好，证实最佳反应条件有效性。

3 结论与讨论

使用纤维素酶进行预处理，调节pH 4.8、温度45 ℃、酶解时间1.5 h、酶∶陈皮粉1∶30（W/W），在此条件下，进行热回流提取，通过正交试验结果进行分析，得到最佳提取工艺条件：温度85 ℃、乙醇体积分数70%、提取时间3 h、料液比1∶25（g/mL）。在此条件的处理下，橙皮苷提取率为5.99%，相对标准偏差（SRSD）为2.16%（n=3）。

纤维素酶能很好地破坏细胞壁结构，且不破坏橙皮苷结构，使得目标物橙皮苷释放，有效提高产率，选取乙醇作为提取剂是因为甲醇有毒性，会造成环境污染，而水的提取效果相对甲醇、乙醇过低。选择使用纤维素酶预处理，联合乙醇热回流提取法提取橙皮苷，使用该方法能够一定程度地提高橙皮苷提取率，在对于橙皮苷这一生物资源开发利用的过程中提供新思路，采用多种处理方法相结合，在一定程度上会降低污染，提高产率，增加工业生产价值。