上海地区葡萄病毒种类及传毒介体检测鉴定

田沂民,朱雅君,罗金燕,陈 磊,余 慧,易建平,叶 军,于 翠∗

(1上海海关动植物与食品检验检疫技术中心,上海200135;2上海市农业技术推广服务中心,上海201103)

葡萄(Vitis.viniferaL.)是世界上最古老的果树品种之一,具有较高的经济价值,在我国种植面积较大。葡萄病害是影响葡萄生产的主要原因,有超过70种病原菌可侵染葡萄,包括65种病毒、5种类病毒、8种植原体和1种木质部细菌[1]。传统的病原鉴定主要依靠典型症状、寄主类别和原有的经验来大致确定病原种类,然后根据确定的病原种类选择合适的血清、引物或探针进行检测和确认。传统检测方法使用的一个重要前提是对病原的生物学特性、理化特性、血清特性等有预先了解,而在对未知病原物缺乏了解的情况下,传统检测方法则出现耗时长、效率低、易假阴性或假阳性等问题[2]。此外,因病毒株系可能存在较大的序列差异,血清或特异性引物很容易造成检测结果阴性;电镜与生物学接种方法又难以将病原物鉴定至病毒种类。近年来,小RNA测序技术成为植物病毒学研究的强有力工具,该技术具有非序列依赖性的优势,已在非典型症状病原鉴定、混合侵染病原鉴定、病原侵染早期检测、新病原发现、环境中病原种群鉴定等方面应用,对于病原的流行病学和生态学研究起到了非常重要的推动作用。2010年之后,在葡萄上也发现了多种新病毒,如葡萄脉明病毒(Grapevine vein clearing virus,GVCV)与葡萄明脉症状相关,葡萄灰皮诺病毒(Grapevine Pinot gris virus,GPGV)引起葡萄叶片产生褪绿、畸形,葡萄红叶相关病毒(Grapevine redleaf-assoicated virus,GRLaV)引起葡萄红叶病等均是通过该技术鉴定发现的[3-5]。对表现葡萄扇叶病类似症状的葡萄样品进行小RNA测序,发现葡萄浆果内坏死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus,GINV)和葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus,GFabV)与症状发生密切相关[6-7]。

葡萄是上海地区重要的水果种类之一,为明确上海地区葡萄相关的病毒种类,本试验采集带有病毒症状的样品进行小RNA测序以确定侵染病毒种类,并对葡萄园中及周边的昆虫进行病毒检测,以期找到病毒与传毒介体之间的关系。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2017年5—6月,在上海市奉贤区、嘉定区、宝山区和浦东新区5年生以上葡萄园进行病毒病调查,并采集斑点黄化的叶片(图1)作为试验材料,进行病毒检测。2018年4—7月,根据葡萄病毒病检测结果,从浦东新区的葡萄园内通过扫网方式捕捉昆虫,在解剖镜下观察其形态特征进行种类鉴定,取虫口数量较多的植食性昆虫分别检测虫体带毒情况。

图1 感染病毒的葡萄叶片症状Fig.1 Symptoms of grape leaves infected by viruses

1.2 小RNA测序及分析

采集的样品用Trizol(Aldrich-sigma)提取植物总RNA,操作步骤参照说明书进行。提纯的总RNA加入1∕2体积的8 mol∕L LiCl溶液,充分混匀,冰上放置1 h;4℃13 000g离心15 min,沉淀的RNA用75%(体积分数)乙醇洗涤;加入20—50μL无RNase的双蒸水,用枪头吸打数次使之溶解。使用分光光度计测定RNA浓度,并电泳检测RNA质量。

提取的RNA样品委托上海昂朴生物科技有限公司利用Illumina HisSeqTM 2000高通量测序平台进行小RNA测序。Illumina测序得到的原始图像数据经Base Calling转化为序列数据;使用Cut adapt v1.4.2软件切除reads尾部接头和尾部质量低于Q20的碱基,并对原始数据进行质量控制;对经过质量剪切前后的数据分别进行测序,对reads数、reads读长、总碱基数、文库平均插入长度进行统计。采用Velvet软件对clean data中的小RNA进行拼接,设哈希长度(hash_length)值为17。将拼接得到的片段(contigs)序列与NCBI网站下载的病毒参考数据库(ftp:∕∕ftp.ncbi.nlm.nih.gov∕refseq∕release∕viral∕)进行blastn和blastx,根据比对和注释信息进行分析,确定感病葡萄可能携带的病毒种类。

1.3 核酸提取

取剩余样品分别置于无菌自封袋中,用锤子将叶片尽可能敲击破碎,加入适量PBS缓冲液,充分浸泡后分别取100μL上述制备液于1.5 mL离心管中,按照植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司,DP432)或植物总DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司,DP320)的操作步骤进行核酸提取。

分别取不同种昆虫各10头置于自封袋中,用锤子将虫体尽可能敲击破碎,加入适量PBS缓冲液,分别取100μL于1.5 mL离心管中,按照植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)或植物总DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)的操作步骤进行核酸提取。

1.4 RT-PCR和PCR验证

提取植物总RNA或DNA,根据注释的病毒种类设计或使用相关文献引物(表1),采用Takara公司one step RT-PCR Kit进行RT-PCR和PCR验证。使用葡萄双生病毒A(Grapevine geminivirusA,GGVA)、葡萄卷叶伴随病毒2(Grapevine leafroll-associated virus2,GLRaV-2)、岩生葡萄茎痘伴随病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFkV)和葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus,GFabV)特异性引物对样品和虫样分别进行RT-PCR检测,扩增得到的产物进行序列测定和分析,验证小RNA测序结果并确定病毒种类。

表1 病毒检测所用引物Table 1 Primers for virus detection

1.5 GGVA的系统发育树分析

基于GGVA Rep∕C1基因设计扩增引物GGVA-978F∕R(表1),将DNA样品进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序验证。采用NCBI中的BLAST(http:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕)进行相似性查找。通过MEGA 6.0软件的Maximum likelihood法构建系统发育树,bootstrap replications值设为1 000。

2 结果与分析

2.1 葡萄叶片小RNA深度测序检测

对葡萄叶片样品进行测序,得到12 276 277个raw reads和11 758 213个clean reads。使用Velvet软件对clean reads进行组装,并利用NCBI nt库和nr库对拼接片段(contigs)进行blastn、blastx注释,共得到与病毒相关的拼接片段5种21条,其中GGVA有17条,GFabV、GFKV、GLRaV-2、GRSPaV各有1条。GGVA所获得的17个拼接片段可覆整个基因组。

2.2 葡萄叶片RT-PCR或PCR检测

利用GGVA、GFabV、GFKV、GLRaV-2、GRSPaV的特异性引物对测序余样进行扩增验证,如图2所示,从样品中能扩增到5种病毒,且条带大小与预期一致,测序结果也表明扩增条带序列为目的病毒序列。同时对各区采样点采集的葡萄样品进行检测,发现GGVA、GLRaV和GRSPaV在上海地区葡萄中普遍发生(表2)。

图2 葡萄叶片的RT-PCR∕PCR检测Fig.2 Detection of grape leaves by RT-PCR∕PCR

表2 不同葡萄园的病毒检测结果Table 2 Virus detection results from different vineyards

2.3 GGVA的系统发育树分析

在国内很少有对葡萄双生病毒A的报道,NCBI GenBank中所含的序列信息较少。采用RT-PCR获得GGVA Rep∕C1 978 bp序列。通过NCBI blastn比对发现,GGVA-PD序列与GGVA网上序列KX570611、LC424098、KX570614、KX570607的同源性超过99%。利用MEGA 6.0软件建立基于GGVA Rep∕C1基因的ML进化树,可以看出GGVA-PD与GGVA形成一簇,而与其他双生病毒关系较远(图3),表明本次采集的样品GGVA-PD为GGVA的一个分离物。

2.4 昆虫体内病毒检测

在发病的葡萄园内捕捉到虫口密度较大的6种植食性昆虫,烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)、茶黄蓟马Scirtothrips dorsalisHood、狭领纹唇盲蝽Charagochilus angusticollis、菊方翅网蝽Corythucha marmorata(Uhler)、桃蚜Myzus persicae和寡脉蝇Asteia amoenaMeigen,分别提取核酸,采用RT-PCR或PCR方法分别对GGVA、GFabV、GFkV、GLRaV-2、GRSPaV 5种病毒进行检测。GFabV、GLRaV-2和GRSPaV在上述6种昆虫体内均未检出,GGVA在6种昆虫体内均能检出,GFkV仅在狭领纹唇盲蝽体内检出(图4)。GGVA在6种昆虫体内普遍存在,表明其存在较高虫传风险。

图4 昆虫体内病毒的RT-PCR∕PCR检测Fig.4 Detection of viruses in insects by RT-PCR∕PCR

3 讨论

在葡萄病害调查过程中,发现上海葡萄园主要采用精细化管理,表现明显症状的植株相对较少,从4个沪郊葡萄园中采集的表现轻微黄化症状的叶片混合后进行小RNA测序,检出GGVA、GFabV、GFkV、GLRaV-2和GRSPaV 5种葡萄病毒,利用RT-PCR和PCR方法进行验证,二者结果一致。可见,上述5种病毒可能是上海地区葡萄病毒病的主要病源。但由于葡萄存在多种病毒复合侵染现象,还需通过分离接种等试验进一步明确病毒与症状之间的关系。

GGVA是2017年美国在对韩国进口的2种鲜食葡萄上利用深度测序技术筛查发现的葡萄新病毒[10],研究者对加州地区葡萄园调查结果显示GGVA发生率仅为1.74%。2018年Jo等[11]在韩国调查葡萄病害时,也在多个葡萄品种中首次检出该病毒。其后,范旭东等[6]在山东、辽宁、四川、北京等地葡萄园进行调查,发现GGVA在一些引进的栽培品种如‘夏黑’上发生普遍,而本土品种则未检出GGVA,说明我国境内检出的GGVA可能是近几年葡萄品种引进随种苗传带入境,需对葡萄等带毒风险高的种苗实施严格的检疫。

在发病葡萄园进行昆虫采集,并对其进行病毒检测。利用PCR或RT-PCR方法在粉虱、蓟马、狭领纹唇盲蝽、菊方翅网蝽、蚜虫和寡脉蝇体内均检出GGVA。GGVA为双生病毒科病毒,是典型的虫传病毒,文献报道双生病毒的主要传毒介体为粉虱、叶蝉等[12],蓟马、狭领纹唇盲蝽、菊方翅网蝽、寡脉蝇尚未见报道。因此,这几种昆虫虽然带毒,是否传毒、传毒特点和危害程度需要进一步研究。对虫传病毒而言,由于昆虫在葡萄园中普遍存在,数量庞大,通过采集传媒昆虫监测田间病毒发生情况,可大大将病毒发生预警时间提前,以便采取必要的防控措施,减少农作物的损失。