基于网络药理学的泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的潜在机制研究

赵沛涵 曹凤 陈昕力 陈丹 李思霆 王朝阳

摘要 目的：采用网络药理学方法探讨泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的依据，预测泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的作用机制。方法：通过数据库检索，得到失眠、抑郁的疾病基因及泻心通腑汤中活性成分的作用靶点;并筛选出泻心通腑汤的中药活性成分在治疗失眠伴抑郁过程中所涉及的功能及通路，最终构建“中药-活性成分-靶点-通路”网络。结果：通过网络药理学方法得到泻心通腑汤中50种活性成分可与失眠伴抑郁的191个疾病靶点相关联，KEGG富集分析得到通路124条。结论：泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁可能是通过多靶点、多成分起到作用，而其中PI3K/AKT信号通路为泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁最有可能起作用的通路。

关键词 泻心通腑;失眠;抑郁;网络药理学;作用机制

Abstract Objective：To predict the mechanism of Xiexin Tongfu Decoction in the treatment of insomnia depression，the network pharmacology method is applied in the paper.Methods：By retrieving database search，the disease genes of insomnia and depression and the targets of the active ingredients in Xiexin Tongfu Decoction were obtained; and the functions and pathways involved in the treatment of insomnia and depression were screened out.And finally a “Chinese Medicinal-Active Ingredient-Target-Pathway” network was built.Results：The 50 active ingredients in Xiexin Tongfu Decoction can be associated with 191 disease targets of insomnia and depression through network pharmacology.KEGG enrichment analysis revealed 124 pathways.Conclusion：The treatment of insomnia with depression by Xiexin Tongfu Decoction may be through multiple targets and multiple components，and the PI3K/AKT signaling pathway is the most likely pathway for the treatment of insomnia with depression by Xiexin Tongfu Decoction.

Keywords Xiexin Tongfu; Insomnia; Depression; Network pharmacology; Mechanism

中圖分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.13.008

抑郁症作为一种临床常见的全球范围发病率逐年上升的精神疾病，目前已成为全球疾病负担的第三大贡献[1]。失眠是以频繁而持续的入睡困难或睡眠维持障碍，以致睡眠满意度不足为特征的睡眠障碍[2]。目前研究表明，失眠与抑郁症是同一病机在不同发展阶段的2个方面，为异病同因，并可互相转变[3]。

抑郁症在中医被归为“郁证”“脏躁”“梅核气”“百合病”的范畴，多因七情所伤，情志不遂，肝气郁结导致肝失疏泄、脾失健运、心失所养、脏腑阴阳气血失调。《素问·举痛论》说：“思则心有所存，神有所归，正气留而不行，故气结矣。”[4]失眠症在传统医学中归属“不寐”“目不瞑”的范畴。《灵枢·口问篇》云：“阳气尽，阴气盛，则目暝;阴气尽而阳气盛，则寤矣。”[5]故不寐的病机为营卫失和，神魂失敛，病位主要在心。

泻心通腑汤为王朝阳教授承袭《道德经》中“虚其心，实其腹”之思想、《黄帝内经》中“七损八益”所蕴含的泻心益肝之理，以及《伤寒杂病论》中关于泻心汤、阳旦汤、黄连阿胶汤的核心治法，通过脉证结合中医气化结构理论自拟的治疗失眠伴抑郁的中药复方，核心组成为半夏、柴胡、黄连、黄芩、干姜。泻心通腑汤以泻其心，降其胃，和其胆，交心肾为治法，旨在“虚其心，实其腹，弱其志，强其骨”。

本研究旨在探析泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的中药物质基础和可能的作用机制，借助网络药理学技术，根据“中药-活性成分-靶点-通路”间的关系探究该方治疗失眠伴抑郁的活性成分、相关靶点和影响到的通路共同作用机制，以期为后续的研究工作提供证据和基础。

1 资料与方法

1.1 筛选泻心通腑汤活性成分和相关靶点 以泻心通腑汤中所含5味中药的化学成分为检索词，在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）数据库检索，以口服利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%并且类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18为标准筛选出泻心通腑汤活性化合物成分。通过SymMap（https：//www.symmap.org/）数据库收集5味药物中成分分别所对应的靶点。

1.2 筛选失眠伴抑郁相关靶点 以“Depression”“Sleep Initiation and Maintenance Disorders”作为关键词在比较毒物遗传学数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：//ctdbase.org/）中检索、筛查失眠伴抑郁相关靶点，整合出疾病靶点数据库。

1.3 构建泻心通腑汤化合物-靶点网络关系 将药物和疾病的交集靶点上传至STRING（https：//string-db.org/）数据库，可获得泻心通腑汤和失眠伴抑郁之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）关系，利用Cytoscape 3.7.2软件（http：//www.cytoscape.org/）生成化合物-靶点相互作用的网络图并进行拓扑参数分析，以介度、紧密度以及连接度的中位数为标准来确定化合物-靶点网络核心靶点。

1.4 构建PPI网络并筛选关键靶点 将所得靶点上传至STRING数据库，进行蛋白质-蛋白质相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）分析。将研究物种设置为“Homo Sapiens”（人）、最低互作评分设置为0.40;再将最低互作评分设置为0.99，其余参数保持默认设置，得到泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的核心PPI网络关系。选用Cytoscape 3.7.2软件中的“Network Analyzer”对PPI网络进行拓扑分析，将结果中自由度（Degree）、介度（Betweenness）和中心性（Closeness）都大于平均值的靶点作为所有靶点中的关键靶点。

1.5 KEGG富集分析 将以上检索得到的基因导入DAVID数据库（https：//david.ncifrcf.gov/），物种选择“Homo Sapiens”（人），对泻心通腑汤和失眠伴抑郁的共同作用靶点蛋白做京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，筛选出P<0.05的泻心通腑汤和失眠伴抑郁共同靶点所富集的信号通路。

1.6 构建泻心通腑汤“中药-活性成分-靶点-通路”网络 筛选KEGG富集分析中排名前20且不属于特异性疾病通路的通路，与靶标互作网络中的靶标进行匹配，并将中药、活性成分、通路、靶标分别上传至Cytoscape 3.7.2软件中，构建泻心通腑汤“中药-活性成分-靶点-通路”网络图。

2 结果

2.1 泻心通腑汤活性成分及靶点筛选结果 在TCMSP数据库中设定OB与DL值，剔除在SymMap数据库中无靶点对应的成分，最终获得有效成分为黄连10个，黄芩21个，柴胡9个，半夏11个，干姜5个，共56个有效成分，剔除重复值后得到共50个活性成分，200个相关靶点。见表1～2。

2.2 失眠伴抑郁靶点检索结果 CTD数据库中可检索到失眠、抑郁靶点432个，取得疾病与泻心通腑汤的交集靶点191个。

2.3 泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的核心靶点分析结果 选用STRING数据库，分析泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁靶点之间的交集基因，选择数据库中“Homo Sapiens”（人）物种，做所得191个靶点的PPI关系图。将所得靶点导入Cytoscape 3.7.2软件进行PPI网络拓扑分析，选用Cytoscape 3.7.2软件中“Network Analyzer”，定义关键靶点为自由度（Degree）、介度（Betweenness）和中心性（Closeness）均大于平均值的靶点，根据Degree值降序排列得到核心靶点AKT1。见表3。靶点蛋白及其互作关系见图1，关键靶点之间的关系见图2。

2.4 KEGG信号通路分析结果 泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁共涉及191个相关靶点，将其导入DAVID数据库进行KEGG富集分析得到124条通路，其中P<0.05的通路有37条，说明泻心通腑汤可能通过这些通路起到治疗失眠伴抑郁的作用。见图3。

2.5 构建泻心通腑汤“中药-活性成分-靶点-通路”网络图 筛选出富集分析中排名前20且不属于特异性疾病通路的通路，将中药、活性成分、靶点、通路分别上传至Cytoscape 3.7.2软件中，将4者进行匹配，构建“中药-活性成分-靶點-通路”网络图。见图4。

3 讨论

泻心通腑汤具有泻其心，降其胃，和其胆，交心肾之效，王朝阳教授临床选用该方治疗失眠伴抑郁具有确切的效果。本研究借助网络药理学方法，构建泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁“中药-活性成分-靶点-通路”的综合网络，以期系统性揭示其物质基础及其分子机制。

3.1 泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的活性成分分析

数据挖掘、整理筛查后获得泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的活性化学成分总计为80个（表2）。复方药物的活性成分所对应的靶点由高到低分别为：黄连中的成分槲皮素（Quercetin）、柴胡中的成分山柰酚（Kaempferol）、黄芩中的成分汉黄芩素（Acacetin）、柴胡中的成分异鼠李素（Isorhamnetin）、黄芩中的成分金合欢素（Wogonin）和半夏中的成分卡文定碱（Cavidine），可以推断以上成分在泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁中可能起到关键作用。相较而言，干姜所包含的靶点相对较少，说明其成分在泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁中特异性作用较低。槲皮素作为一种天然的多羟基黄酮化合物，具有保护神经、抗炎、抗衰老等多方面作用。在治疗精神疾病方面，槲皮素主要通过改善脂质代谢和海马、前额叶皮层突触相关蛋白，调节下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal，HPA）轴活性，缓解焦虑、抑郁、认知低下的状态进而改善精神行为[6-7]。研究发现，作为一种黄酮醇类化合物，山柰酚能抑制神经元细胞凋亡、促进神经细胞再生，调控和激活与抑郁症相关的信号通路，延缓神经退行性疾病的发展，提高抑郁症模型小鼠的认知能力[8-9]。此外，在免疫方面，山柰酚则是通过抑制大鼠神经炎症发生的方式抑制海马体中IL-1β、TNF-α和NO的表达[10]。汉黄芩素在人体内可转化为黄芩苷和汉黄芩苷，通过发挥镇静催眠、安神定惊等作用治疗失眠[11]。金合欢素为天然黄酮类化合物，能通过减少神经细胞的凋亡、炎症介质的分泌，抑制海马突触体中谷氨酸的释放，有效地避免红藻氨酸（Kainic Acid，KA）诱导的兴奋毒性，起到神经保护作用[12]。

3.2 泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的关键靶点分析 基于Cytoscape软件对PPI网络进行拓扑分析，得到AKT1、TP53、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3、TNF、JUN等20個关键靶点，提示泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁可能是作用于这些靶点进而发挥其治疗作用。AKT1作为其中的核心靶点，其靶蛋白活性直接能够影响抑郁程度。AKT1主要通过强化海马干细胞的活性和提高抗抑郁药物疗效，影响其下游底物的丝氨酸和（或）苏氨酸磷酸化进而调节抑郁症的许多进程[13]。泻心通腑汤可能是通过对促炎细胞因子的抑制作用降低人体内TNF-α的分泌水平和活性，以实现抗抑郁作用[14-15]。此外，以肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）为代表的靶点可调节睡眠、促进胶质细胞生长和大脑发育影响人体的炎症反应和免疫功能，干预失眠伴抑郁的进程[16]。IL-6和TNF作为官方的睡眠调节物质、重要的炎症介质，失眠和抑郁能够影响人体炎症反应和全身免疫功能，改变人体血清IL-6和TNF水平，造成IL-6和TNF的升高[17]。血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）作为一种主要的促血管新生因子，普遍分布于神经系统，能够特异地作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，调控血管内皮细胞的增殖分化、血管形成等许多生理和病理情况，在抑郁症的治疗中发挥重要的作用;动物实验中有证据表明，抑郁大鼠抗抑郁药物治疗后VEGF的表达增加[18-19]。

PPI网络结果显示，泻心通腑汤的靶蛋白之间存在着复杂的相互关系，能够对多种过程、分子及通路产生影响。中药-活性成分-靶点-通路图显示出泻心通腑汤抗失眠伴抑郁作用是由多重成分、靶点、通路共同起效的结果。

3.3 泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的通路结果分析

KEGG分析可知，PI3K/AKT信号通路为泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁最有可能起作用的通路，其作用机制可能是抑郁引起PI3K和AKT的mRNA含量增加，进一步促使基因表达，启动PI3K/AKT信号通路，使PI3K、AKT蛋白含量增加，经过一系列复杂的级联反应后，促使人体血清中参与睡眠进程的免疫调节因子IL-6、TNF持续性大剂量升高，参与血管新生的VEGFA细胞因子升高，进而干预治疗失眠伴抑郁的过程[20-22]。PI3K下游的核心靶标AKT1对抑郁患者的严重程度、焦虑状态产生影响;GSK-3β多态性影响抑郁症发病;GSK-3β、mTOR与抗抑郁药物的起效速度关系密切[23]。

PI3k/AKT/NF-κB信号通路过度激活与抑郁的发生和发展密切相关;调节过度激活的海马核因子κB信号通路或利用药物抑制核因子κB的过度激活，可减轻抑郁模型动物的抑郁行为[24]。

PI3K/AKT/FoXO信号通路在精神疾病中逐渐引起重视，该通路通过影响下游多种靶点、靶蛋白的活化状态以促进细胞成活、抑制细胞凋亡进而起到脑保护作用;而抗抑郁药物很有可能是通过PI3K/AKT/FoxO信号通路发挥神经保护作用，进而实现抗凋亡作用[25]。

本研究采用网络药理学的方法对泻心通腑汤治疗失眠伴抑郁的机制及可能发挥作用的通路进行探讨和预测，为进一步寻找泻心通腑汤的有效成分和作用通路奠定理论基础。泻心通腑汤作为一个中药复方，其活性成分能够通过多个靶点、多条通路对失眠伴抑郁进程整体调控。本研究得出泻心通腑汤可以从以下方面发挥治疗失眠伴抑郁的作用：1）作用于AKT1靶点，提高其蛋白活性促进抗抑郁药物起效。2）调节BDNF、谷氨酸、IL-6、TNF等炎症介质的表达。3）调节PI3K/AKT通路，促进神经营养因子释放、脑血管新生，抑制谷氨酸能系统功能，抑制海马神经元凋亡，抑制抑郁症神经炎症的发生，辅助抗抑郁药物快速起效。4）影响PI3K/AKT下游的核因子κB信号通路、FoXO信号通路，抑制核因子κB的过度激活、抑制细胞凋亡，发挥脑保护作用。

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（2020-01-12收稿 责任编辑：魏庆双，徐颖）