P物质的表达减少减轻A2腺苷受体基因敲除小鼠 心肌梗死后的神经病理性疼痛

曾小林，王 艳，卢加发，李海鹰，韩 伟

冠心病是全世界死亡的主要原因，以往对心肌梗死的研究大多集中在病因病机和治疗上，对疼痛症状本身在发病机制上的研究较少。心绞痛是一种内脏痛[1]，是一种极其复杂的病理过程。在临床上，有一部分心绞痛患者因严重的弥漫性病变、小血管病变、再狭窄以及移植血管桥血栓等原因被排斥在血运重建手段之外。针对这些顽固性的心绞痛，其临床治疗效果不佳。已有研究表明，心肌梗死的病人所经历的频繁的严重的心肌缺血性疼痛与心肌坏死时大量的P物质（Substance P，SP）释放到心肌内有关[2-3]。Zhang[4]和Guo等[5]研究表明，缺血区SP的表达明显高于非缺血区。心绞痛疼痛刺激感觉神经末梢会释放大量的疼痛递质，如SP、降钙激素基因相关肽（Calcitonin-Gene-Related Peptide，CGRP）等，可产生神经源性反应，加重心肌缺血缺氧损伤。急性心肌缺血痛觉干预，阻断疼痛因子和介质如腺苷A2A受体（Adenosine A2A receptor）和SP受体神经激肽1（Neurokinin-1，NK-1）的过度表达，可能有心肌保护作用。

心绞痛疼痛主要通过腺苷A1受体传导，这种作用可通过SP增强[6]。目前已发现四种腺苷受体（Adenosine Receptors，AR），即腺苷A1、A2A、A2B和A3受体。根据心血管疾病的解剖分布主要与A1受体和A2A受体有关。2004年Kelly[7]和Lopes[8]通过Western blot发现并证实A2A受体存在于相对较低水平的体感皮层；Ledent[9]研究表明，A2A受体敲除小鼠在热量测试中表现出低痛觉。因此，我们推测A2A受体可能参与了心绞痛疼痛的过程[10]，但这方面的研究尚未引起重视。这两种腺苷受体刺激心肌组织的感觉神经末梢，神经末梢向心肌组织释放大量的痛因子，如SP、CGRP等，形成一系列的痛反应。

本研究采用药物（拮抗剂）干预和基因敲除的方法，探讨腺苷A2A受体和P物质在心肌梗死疼痛中的作用，阻断两个最重要因子的过度表达，可能具有心脏保护作用，为心绞痛疼痛干预提供理论依据，探索治疗心绞痛特别是顽固性心绞痛的新方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组所有动物实验均符合国家科学院实验动物资源研究所生命科学委员会国家研究所颁布的《实验动物护理和使用指南》委员会，所有试验操作遵循动物使用相关伦理要求。实验在成年C57BL/6J腺苷A2A基因敲除小鼠（Knock Out，KO）和野生型小鼠（Wild-Type C57BL/6J，WT）上进行，小鼠体重20～30 g，雌雄不限，购自温州医科大学实验动物中心，通过永久性结扎左冠状动脉前降支诱发急性心肌梗死。

1.1.1 分组实验将36只野生型小鼠随机分为3组，每组12只。3组分别为（1）假手术组（Sham Group）加生理盐水（Normal Saline，NS）（Sham Group + NS）；（2）急性心肌梗死模型组加生理盐水（WT+NS）；（3）急性心肌梗死模型组加L-703606（1 mg/kg/天）（WT+SP）。将24只腺苷敲除小鼠随机分为2组，每组12只。两组分别为（1）急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）模型组加生理盐水（KO+NS）；（2）AMI模型组加L-703606（1 mg/kg/天）（KO+SP）。所有小鼠均于术后半小时腹腔注射0.2 ml生理盐水，于第14天定时注射。

1.2 实验材料和仪器试剂分光光度计（型号UV-1600）、凝胶文件系统（型号Bio Best 200e）、Trizol（型号Invitrogen Life Technologies）、Realtime PCR Instrument（型号ABI7700）、动物呼吸器（型号DHG-30）、心电图（型号ECG6511）、超声仪器（型号65l8w）、2,3,5-三苯基-2H-四唑氯化物（型号TTC）、NK1受体拮抗剂（型号L-703606）、SYBR Green I、PCR热循环仪。

1.3 建立心肌梗死模型小鼠用氯胺酮100 mg/kg腹腔内麻醉，在手术灯光下用20号静脉留置针套管插管，连接小动物呼吸机辅助呼吸，潮气量2～3 ml，通气频率90～100次/min。用自制的开胸器开胸，结扎左冠状动脉前降支近端。术者观察到Ⅱ导联立即（Statim/Immediately，ST）段抬高，左室前壁颜色明显变深灰色或紫色，收缩力减弱或消失，以上特征是造模成功的标志。停止机械通气直至恢复自主呼关胸缝合胸壁。假手术组也进行了同样的手术，只是冠状动脉周围的缝线没有打结。

1.4 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（2，3，5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）染色取心肌标本作冠状切片，室温下用2%TTC染色20 min，数码相机拍摄，并进行统计学分析。正常心肌组织呈鲜红色，心肌梗死组织呈白色。

1.5 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）试验测定心肌组织IL-1水平分别于术前24 h、术后24 h、术后14天取心肌组织，使用ELISA试剂盒测定心肌组织IL-1水平的表达。

1.6 福尔马林疼痛试验术后第14天，在小鼠左后足底部皮下使用微型注射器注射5%的福尔马林溶液20 μL后， 立即置于透明的玻璃缸中观察，实验过程中避强光，保持环境安静，使用数码照相机记录。以舔注射足时间为小鼠痛反应指标。分别记录小鼠在0～5 min和15～30 min的累积舔足次数，分别代表I相和Ⅱ相疼痛强度。行为学观察采用双人双盲法，即观察者不知道实验分组的具体情况。

1.7 qRT PCR检测用TRIzol试剂盒从心肌组织中提取总核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），然后用转录酶反转录成互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）。根据试剂盒的说明，使用SYBR进行实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）®预混料Ex TaqTMII套件和β-肌动蛋白被选为一个内部参考基因。相对定量法（2-△△CT法）计算目的基因的相对转录水平，每个实验重复3次。SP和β-actin的引物列表，如表1所示。

表1 SP和β-actin的引物列表

1.8 统计分析所有数据用SPSS 19.0统计软件处理。实验数据以平均值表示±标准差（Standard Deviation，SD）。正态性检验后，采用单因素方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）比较多组样本均值。P<0.05，差异显著。

2 结 果

2.1 成功构建小鼠心肌梗死模型采用开胸结扎小鼠冠状动脉前降支建立小鼠急性心肌梗死模型。心电图结果，如图1所示，冠脉结扎前组正常。急性心肌梗死后1 min和5 min，ST段明显升高。术后第14天可见Q波的形成，心脏彩超结果如图2所示。显示术后14天左室壁运动明显减弱，变薄，左室腔变大，射血分数明显降低。此外，TTC染色结果，如图3所示，显示假手术组小鼠心肌呈砖红色；急性心肌梗死模型组为浅白色。基于以上结果，我们成功构建了小鼠急性心肌梗死模型。

图1 小鼠急性心肌梗死心电图结果

图2 小鼠急性心肌梗死心脏彩超结果

图3 小鼠心肌梗死TTC染色

2.2 腺苷A2A受体敲除及P物质对IL-1水平在小鼠心肌组织中的表达ELISA结果表明，与假手术组相比，WT+NS组心肌组织IL-1水平明显升高；与WT+NS组比较，WT+SP组和KO+NS组心肌组织IL-1水平明显低于WT+NS组，其中WT+SP组高于KO+NS组。说明阻断了腺苷A2A受体和P物质，IL-1表达水平明显下降，如图4所示。

图4 ELISA法测定心肌组织的IL-1水平

2.3 福尔马林疼痛试验福尔马林刺激模型自Dubuisson和Dennis[11]在1977年建立以来，第I相行为反应在刺激后立即出现，持续约5 min，是直接化学刺激引起。之后动物处于安静状态，称之为间歇期。第II相行为反应在刺激15～30 min,后疼痛反应逐渐减退，Ⅱ相是炎症反应所致。福尔马林Ⅱ期疼痛实验中，WT+NS与WT+SP比较，小鼠舔体次数明显减少（P<0.01）。表明P物质阻滞剂能明显减轻AMI小鼠的疼痛。此外，KO+NS组的舔肉次数明显少于WT+NS组（P<0.01），KO+SP组的舔足次数明显少于WT+SP组（P<0.05）如图5所示。结果证实了A2A受体敲除后，AMI小鼠的疼痛减轻，而P物质阻滞剂能进一步减轻A2A受体敲除后小鼠的疼痛。

图5 福尔马林实验

图6 P物质的RT-PCR法定量结果图

2.4 腺苷A2A受体敲除和P物质对小鼠心肌组织SP表达的影响 结果表明，如图5所示，与假手术组相比，WT+NS组心肌组织SP的mRNA和蛋白表达水平显著升高；与WT+NS组比较，WT+SP组和KO+NS组心肌组织SP的mRNA和蛋白表达水平明显降低，其中WT+SP组高于KO+NS组；KO+NS组和KO+SP组之间没有明显差异。

3 讨 论

冠心病是危害我国人民身体健康的“头号杀手”，以往对心肌梗死的研究大多集中在病因病机和治疗上，对疼痛症状本身在发病机制上的研究较少。本实验通过结扎冠状动脉前降支成功建立急性心肌梗死模型。在福尔马林试验中[11]，腺苷A2A受体和P物质影响福尔马林疼痛的Ⅱ期，而不影响Ⅰ期。以往的研究表明，心绞痛主要通过腺苷A1受体，这种作用可被SP增强，而腺苷A2受体的激活通过增加产生促痛或增强疼痛的特性[12]。Ledent[9]研究表明，A2A受体敲除小鼠进行了痛觉减退温度热试验，与我们福尔马林试验的结果相同。福尔马林试验Ⅱ期为局部炎症和炎性疼痛物质的毒性刺激，提示腺苷A2A受体和SP参与了心绞痛的神经源性炎症；Longhurst[13-14]等提出在心肌缺血疼痛时存在神经源性假说，大量的化学介质刺激心脏感觉神经后可能导致心脏传入通路激活，多种心血管物质和神经末梢的促炎介质释放，导致“神经源性炎症”反应，加重心肌损伤；阻断疼痛因子的过度表达可能具有心肌保护作用。SP是伤害性信息初级传入的神经递质，SP与许多炎症细胞、炎症介质和细胞因子之间相互作用，表现在:（1）SP调节多种细胞产生多种细胞因子，促进单核细胞分泌IL-1、IL-6等炎症因子;（2）炎性介质和炎性细胞也能刺激SP从外周感觉神经末梢分泌，因而在SP与炎症介质之间形成了相互作用的效应，使炎症反应的级联效应得以实现。本实验测定了IL-1一个炎症因子，其中腺苷A2A受体敲除小鼠和P物质（WT+SP组）的IL-1表达最少，进一步验证了心绞痛的神经源性假说。Gaspardone A[15]研究表明，大量的SP释放到心肌梗死患者的心肌中出现频繁的剧烈疼痛，应用SP受体（NK-1）拮抗剂CP-99、994明显减轻术后疼痛[16]，提示伤害性信号转导通路中的SP是一种重要的神经递质。我们的结果表明，阻断腺苷A2A受体和SP的过度表达可以减少福尔马林Ⅱ期舔后爪的次数，这个间接提示阻断疼痛因子的过度表达可以减少心肌梗死面积。痛觉干预可减少交感神经过度活动，减轻疼痛和焦虑，减轻神经内分泌应激反应，降低心肌耗氧量，达到心肌保护的目的。

5组小鼠的P物质的RT-PCR法定量结果提示，基因敲除小鼠和野生型小鼠加生理盐水组，SP的表达有显著差异；两组敲除小鼠之间的的P物质表达量无差异，与观察到福尔马林试验相符，两组敲除小鼠在II相期间舔足次数无统计学差异。所以我们推测，在急性心肌梗死时，自身腺苷大量释放引起剧烈的疼痛，刺激周围神经末梢的P物质高度表达，进一步加剧疼痛。而阻断了腺苷A2A受体的表达，腺苷释放明显减少，这样P物质的表达也明显减少，可能与减少IL-1、IL-6等炎症因子的表达相关，如两者之间具体的相互作用的机制需进一步探讨。

综上所述，我们成功构建了急性心肌梗死小鼠模型，腺苷A2A和P物质参与了心肌梗死的病理生理过程，阻断腺苷A2A受体和P物质受体神经激肽1的过度激活可降低心绞痛的程度，可能有心肌保护作用。