不同产地沙棘中总黄酮、总多酚含量测定及其抗氧化活性研究

2021-08-26胡月月

化学与生物工程 2021年8期

李娜，胡月月，葛亮*

(1.新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.乌鲁木齐市中医医院，新疆乌鲁木齐 830000)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)为胡颓子科沙棘属多年生灌木或乔木，又名酸醋柳、黑刺等[1]，在维护和改善水、土壤等环境起着重要作用[2]。我国沙棘产地多元化，多分布在新疆、内蒙、陕西、青海等地，占世界沙棘99%以上[3]。沙棘含有丰富的化学成分[4]，其中酚类和黄酮类具有抗氧化活性[5]。沙棘是国家卫健委公布的药食同源中药[6]，含有大量的营养与生物活性物质，具有较好的营养保健作用和较高的药用价值，具有增强脾胃运化功能、止咳化痰、活血化瘀的功效，可用于治疗心血管疾病、脾虚食欲不佳、食物积聚、腹痛、心胸痛、瘀血经闭等[7-10]。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

沙棘，产自新疆、内蒙、陕西、山西、青海、甘肃等，经新疆医科大学中医学院李永和主任药师鉴定为胡颓子科沙棘属。

芦丁标准品(批号809F024)，北京索莱宝科技有限公司；没食子酸标准品(批号2014052801)，成都科龙化工试剂厂；DPPH自由基(批号217-591-8)，东京化工产业；NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、Folin-酚等均为分析纯；实验用水为蒸馏水。

TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；HH-S4型恒温水浴锅，金坛医疗仪器厂；AL204型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

标准溶液：称取芦丁标准品20.04 mg，加入60%乙醇，超声溶解后，定容至刻度，配制成0.200 4 mg·mL-1芦丁标准溶液。称取没食子酸标准品10.05 mg，加入蒸馏水充分溶解后，定容至刻度，配制成0.100 5 mg·mL-1没食子酸标准溶液。

样品溶液：称取2 g沙棘粗粉，按料液比1∶20(g∶mL)加入60%乙醇，水浴回流1 h，过滤；残余沙棘渣重复上述操作，合并滤液，用60%乙醇补足至100 mL；取25 mL，用蒸馏水补足至50 mL。

1.2.2 标准曲线的绘制

芦丁标准曲线：吸取芦丁标准溶液3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加入1 mL 5%NaNO2溶液，混匀后静置6 min；再加入1 mL 10%Al(NO3)3溶液，混匀后静置6 min；最后加入10 mL NaOH溶液，用60%乙醇补足，混匀后静置15 min，测定各溶液在500 nm处吸光度，以未加芦丁标准溶液的试液置于样品池内用于扣除空白；以芦丁浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。线性回归方程为A=10.993c+0.0055，R2=0.9997，线性范围为0.024～0.064 mg·mL-1。

没食子酸标准曲线：吸取没食子酸标准溶液0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL Folin-酚试剂、1.5 mL 15%Na2CO3溶液，用蒸馏水补足，混匀，75 ℃水浴15 min，测定各溶液在760 nm处吸光度，以未加没食子酸标准溶液的试液置于样品池内用于扣除空白；以没食子酸浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。线性回归方程为A=100.38c+0.027，R2=0.9995，线性范围为0.002～0.007 mg·mL-1。

1.2.3 样品测定

分别吸取适量新疆、内蒙、陕西、山西、青海、甘肃沙棘提取物溶液，按1.2.2方法测定吸光度，依据线性回归方程计算6个产地沙棘中总黄酮、总多酚的含量。

1.2.4 抗氧化活性评价

1.2.4.1 DPPH自由基清除实验

参照文献[11-14]配制0.4 mg·mL-16个产地沙棘提取物溶液，稀释成浓度(mg·mL-1)分别为0.027、0.053、0.08、0.11、0.13、0.16、0.19、0.21、0.24、0.27、0.30的样品溶液。取3 mL各浓度样品溶液，加入2 mL 1×10-4mol·L-1DPPH自由基溶液，混匀，静置于背光处，30 min后测定溶液在516 nm处吸光度，每个沙棘样品溶液测3次，按式(1)计算DPPH自由基清除率。以VC为阳性对照，将无水乙醇置于样品池内用于扣除空白。

(1)

式中：A0为2 mL DPPH自由基溶液+3 mL无水乙醇的吸光度；A1为2 mL无水乙醇+3 mL沙棘样品溶液的吸光度；A2为2 mL DPPH自由基溶液+3 mL沙棘样品溶液的吸光度。

1.2.4.2 ABTS自由基清除实验

参照文献[11-14]配制10 mg·mL-16个产地沙棘提取物溶液，稀释成浓度(mg·mL-1)分别为0.01、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00的样品溶液。取0.2 mL各浓度样品溶液，加入3.9 mL ABTS自由基溶液，混匀，静置于背光处，15 min后测定溶液在734 nm处吸光度，每个沙棘样品溶液测3次，按式(2)计算ABTS自由基清除率。以VC为阳性对照，将无水乙醇置于样品池内用于扣除空白。

(2)

式中：A0为3.9 mL ABTS自由基溶液+0.2 mL无水乙醇的吸光度；A1为3.9 mL无水乙醇+0.2 mL沙棘样品溶液的吸光度；A2为3.9 mL ABTS自由基溶液+0.2 mL沙棘样品溶液的吸光度。

(3)

式中：A0为1 mL蒸馏水替代沙棘样品溶液的吸光度；A1为1 mL蒸馏水替代邻苯三酚溶液的吸光度；A2为Tris-HCl溶液+沙棘样品溶液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

精密度：分别取同一芦丁标准溶液和没食子酸标准溶液各6份，按1.2.2方法测定吸光度，其RSD值分别为0.19%和0.10%。表明该方法精密度良好。

稳定性：分别取芦丁标准溶液和没食子酸标准溶液各1份，按1.2.2方法在0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min测定吸光度，发现吸光度在90 min内稳定，其RSD值分别为0.60%和0.50%。

重复性：取同一沙棘样品溶液6份，按1.2.2方法测定吸光度，计算沙棘总黄酮和总多酚吸光度的RSD值分别为1.0%和2.2%。表明该方法重复性良好。

加标回收率：取6份已知含量的同一沙棘样品溶液，分别加入适量标准溶液，按1.2.2方法测定吸光度，计算加标回收率(表1)。沙棘总黄酮、总多酚加标回收率分别为：120%：(99.72±0.62)%、(102.22±0.01)%；100%：(100.77±0.48)%、(102.03±0.01)%；80%：(101.83±0.13)%、(102.78±0.01)%，RSD值均小于1%。表明该方法稳定可行。

表1 加标回收率测定结果(n=6)/%

2.2 样品含量测定

新疆、内蒙、陕西、山西、青海、甘肃等6个产地沙棘中的总黄酮和总多酚含量见表2。

表2 不同产地沙棘中的总黄酮和总多酚含量(n=3)

由表2可知，不同产地沙棘中的总黄酮和总多酚含量有差异。内蒙沙棘中的总黄酮和总多酚含量均最高，分别为38.84 mg·g-1、33.31 mg·g-1；而甘肃沙棘中的总黄酮和总多酚含量均最低，分别为8.50 mg·g-1、12.36 mg·g-1。

2.3 沙棘提取物对DPPH自由基的清除作用

按1.2.4.1方法测定6个产地沙棘提取物对DPPH自由基的清除率，结果如图1所示。

图1 沙棘提取物对DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of Hippophae rhamnoides L.extract on DPPH free radicals

由图1可知，6个产地沙棘提取物对DPPH自由基的清除率均低于VC，但均随浓度的增加逐渐升高；在测定浓度范围内，6个产地沙棘提取物对DPPH自由基的清除作用具有一定量效关系；当浓度高于0.11 mg·mL-1时，新疆沙棘提取物对DPPH自由基的清除率最高；当浓度低于0.11 mg·mL-1时，陕西沙棘提取物对DPPH自由基的清除率最高。