基于线粒体CO Ⅰ 基因序列的红螯螯虾养殖群体遗传结构分析

刘士力，卞玉玲，贾永义，迟美丽，李 飞，郑建波，程 顺，顾志敏，*

(1.浙江省淡水水产研究所 农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省淡水水产遗传育种重点实验室，浙江 湖州 313001； 2.上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306)

红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)又名澳洲淡水龙虾，俗称“小青龙”，原产于澳大利亚北部的热带地区和新几内亚的溪流中，我国于20世纪90年代初引进。该虾具有养殖成本低、出肉率高、肉质好的优良特性[1]，虾壳还可用于制备壳聚糖(壳聚糖在食品、医药、水处理等领域具有广阔的应用前景[2])。相对于克氏原螯虾(Procambarusclarkii)来说，红螯螯虾具有个体大、不打洞和易于捕捞的优点，是克氏原螯虾的替代品种之一，有助于提高养殖种类的的多元化，降低养殖风险。由于该虾是从国外引进的热带虾，在长江中下游地区养殖需要在温室里过冬，因此种虾成活率受到保种条件和技术的影响。同时，由于种虾来源渠道较少、越冬技术要求高，红螯螯虾养殖中极易发生近亲繁殖，会对其遗传多样性产生影响。优良的种群是选育的基础，种群的遗传多样性决定了物种对环境变化的适应能力和选育潜力。对红螯螯虾的遗传多样性进行分析有助于制定科学的引种和选育策略。

线粒体DNA具有结构简单、母系遗传、进化速率快、几乎不发生重组等特点，作为一种重要的分子遗传标记被广泛地应用于水产生物的系统发育、生物地理学和保护生物学研究中[3]，是分子生物学研究的一个热门领域。其中，细胞色素氧化还原酶Ⅰ基因(COⅠ)具有进化速率适中的特点，在水生动物群体遗传学研究中得到了广泛的应用。Baker等[4]运用COⅠ基因中523 bp的片段对15个群体共30尾红螯螯虾进行分析，发现了18种单倍型；彭刚等[5]利用COⅠ基因中831 bp的片段研究了6个养殖群体序列，认为国内红螯螯虾繁养群体保持着较高的遗传多样性。本研究扩增5个国内红螯螯虾养殖群体的线粒体COⅠ基因全长序列进行分析，旨在阐明群体的遗传结构和遗传多样性现状，以期为红螯螯虾的引种和合理开发提供基础资料和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用红螯螯虾于2019年采自国内5个红螯螯虾繁养区，具体包括浙江湖州33尾、海南澄迈38尾、台湾云林27尾、江苏连云港24尾和安徽合肥20尾。样品取尾部肌肉，保存于无水乙醇中，用于后续的群体遗传学分析。

主要试剂：PCR试剂和pMD18-T载体购自宝日医生物技术(北京)有限公司；胶回收试剂盒、大肠埃希菌(Escherichiacoli)DH5α菌株、氨苄青霉素和异丙基硫代半乳糖苷购自天根生化科技(北京)有限公司；用于DNA提取的试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用苯酚-氯仿法提取样本DNA。用1%琼脂糖凝胶检测所获DNA的完整性。将检测合格的DNA溶液于-20 ℃保存备用。

1.2.2 线粒体COⅠ基因片段的扩增与序列测定

根据GenBank上公布的红螯螯虾线粒体基因组(NC_022937)设计引物。引物序列如下：F，5′-AGCCTATCTCAACCTATTCAAG-3′；R，5′-GGAGTCCTAGACATCCTCAT-3′。PCR反应体系为20 μL，其中含有PremixTaq缓冲液10 μL(含Taq酶、dNTP、Mg2+)，上、下游引物(F、R)各1 μL(10 μmol·L-1)，DNA模板2 μL，用灭菌超纯水补足20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共32个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程(上海)股份有限公司采用Sanger法进行双向测序，少量测序有杂峰的样本克隆后再进行测序。

1.2.3 序列分析

使用DNAStar 7.1软件将获得的序列分组后合并成单一fas文件，利用ContigExpress(June 20，2000)软件将所获得的DNA片段拼接在一起，并对照原始序列峰图进行人工校对。采用Clustal X 2.1软件进行比对，利用MEGA 7.0软件统计序列不同碱基的含量，并基于Kimura双参数(K-2-P)模型采用邻接法(NJ)构建红螯螯虾群体遗传距离系统发生树。利用DNAsp5软件统计单倍型(h)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)等遗传多样性参数，进行核苷酸不配对分布计算，采用Microsoft Office Excel 2007软件绘制核苷酸错配分布图。利用Arlequin 3.1软件检验中性分子进化演变，计算Tajima’s D和Fu’s Fs参数以推测群体的历史演化，运用AMOVA方法进行遗传差异分析，计算各群体间的遗传分化系数(Fst)。通过GenBank的Blast功能计算序列相似度。

2 结果与分析

2.1 红螯螯虾线粒体COⅠ序列的变异位点与单倍型分布

红螯螯虾线粒体COⅠ序列扩增产物经过测序拼接，共获得143条长度为1 797 bp的同源序列，将除去两侧trnC和trnL2序列后获得的单倍型提交至GenBank，获得序列号MT966719～MT966753。红螯螯虾线粒体COⅠ区全序列为1 534 bp，其中：变异位点24个，占分析位点的1.6%；变异位点中含有简约信息位点22个；平均转换与颠换的比值(TS/TV)为6.14。主要序列中没有发现碱基缺失和碱基插入。T、C、A、G碱基的平均含量分别为31.7%、24.8%、27.0%、16.6%(表1)，(A+T)的含量(58.7%)明显高于(G+C)的含量(41.3%)，说明红螯螯虾线粒体COⅠ区的碱基组成具有较为明显的偏倚。

表1 红螯螯虾5个养殖群体COⅠ基因序列的碱基组成Table 1 Nucleotide compositions of COⅠsequence in five cultured populations of C. quadricarinatus %

从143个个体中定义了35种单倍型(表2)。其中，来自台湾的养殖群体的单倍型数量最多(13个)，来自江苏的养殖群体的单倍型数量最少(5个)。来自浙江、海南和台湾的养殖群体具有较多的共享单倍型(COⅠ-01、COⅠ-02和COⅠ-03)，这3种单倍型同时也是优势单倍型。来自江苏和安徽的养殖群体除了分别和其他养殖群体共有1个单倍型外，其余单倍型都是该养殖群体所独有的。

表2 红螯螯虾5个养殖群体COⅠ基因序列的单倍型分布情况Table 2 Distribution of haplotypes in COⅠ sequences in five cultured populations of C. quadricarinatus

2.2 红螯螯虾线粒体COⅠ基因序列的遗传结构分析

使用DNAsp5软件计算红螯螯虾5个养殖群体的遗传多样性参数(表3)：来自江苏的养殖群体的单倍型多样性最低(0.739)，来自安徽的养殖群体的单倍型多样性最高(0.881)。来自台湾的养殖群体的核苷酸多样性(0.005 20)最高。以上结果表明，本研究所调查的5个红螯螯虾群体具有不同的遗传多样性。

表3 红螯螯虾群体COⅠ基因序列的遗传多样性参数与中性检验结果Table 3 Genetic diversity parameters and results of neutral test of COⅠ in five cultured populations of C. quadricarinatus

中性检验结果显示：除来自海南的养殖群体的Tajima’s D值为负外，其余养殖群体均为正值；来自浙江和江苏的养殖群体的Fu’s Fs值为正值，而其余3个养殖群体均为负值。另外要说明的是，5个养殖群体的中性检验结果均未通过0.05水平的显著性检验。

红螯螯虾5个养殖群体线粒体COⅠ基因序列的遗传差异AMOVA分析结果表明，群体间的遗传分化系数为0.342 1(P<0.01)，说明整个遗传变异中来自养殖群体间的占34.21%，其余65.79%的遗传变异来自于养殖群体内，5个养殖群体间具有较高程度的遗传分化。

2.3 红螯螯虾单倍型的发生关系

红螯螯虾5个养殖群体的单倍型网络中介图(图1)显示，其单倍型具有一定的分化。来自浙江、海南和台湾的养殖群体的单倍型形成了2个主要分支。大分支以单倍型H1、H2和H5为主，且单倍型之间的中间节点较多，呈网状分布。其中，单倍型H1所占比重较高，且处于连接枢纽的中心位置。另一个大分支以H3为中心，与大分支距离较远。同时，H3还包含较多的来自江苏养殖群体的个体。在这5个养殖群体中，来自浙江和台湾的养殖群体的单倍型具有相对较大的跨度，来自安徽的养殖群体的单倍型较为分散。

图1 红螯螯虾5个养殖群体COⅠ基因单倍型的网络关系图Fig.1 Median-joining network for haplotypes of COⅠ gene in five cultured populations of C. quadricarinatus

2.4 红螯螯虾5个养殖群体的遗传距离分析

利用MEGA 7.0软件测算得知，5个养殖群体间的遗传距离在0.002 63～0.006 81(表4)，遗传距离差距较大。其中，来自浙江与海南的养殖群体的遗传距离最近，来自海南与安徽的养殖群体的遗传距离最远。基于遗传距离构建的系统发生树显示，来自浙江和海南的养殖群体聚为一支，来自台湾和江苏的养殖群体聚为一支，来自安徽的养殖群体单独为一支(图2)。运用Arlequin 3.1软件计算各养殖群体间的遗传分化系数，结果在0.042 77～0.617 28，遗传分化远近与遗传距离一致。

图2 基于线粒体COⅠ基因遗传距离构建的系统发生树Fig.2 Cluster dendrogram of five populations of C. quadricarinatus based on genetic distance of COⅠ gene

表4 红螯螯虾5个养殖群体间的遗传距离(对角线下方)和遗传分化系数(对角线上方)Table 4 Estimates of genetic distance (below diagonal) and genetic differentiation index (above diagonal) among 5 cultured populations of C. quadricarinatus

2.5 红螯螯虾5个养殖群体的动态分析

本研究中，5个养殖群体及其整体的中心检验结果均未通过0.05水平的显著性检验，峰型较为复杂，这与红螯螯虾是一种引入时间不长的外来种，而且繁育过程受到人工操作影响的情况是一致的。来自海南的养殖群体，Tajima’s D和Fu’s Fs值均为负值，但其核苷酸不配对分布图呈现单峰型(图3)，综合判断，认为来自海南的养殖群体近期偏向于经历过群体扩张。来自台湾的养殖群体，其核苷酸不配对分布图呈现出明显的双峰型，且Fu’ s Fs为负值，综合判断，认为来自台湾的养殖群体近期未发生明显的种群扩张。

3 讨论

本研究对红螯螯虾线粒体COⅠ基因序列进行了分析，(A+T)的含量高于(G+C)，呈现出明显的(A+T)偏好性。这与大部分甲壳类和其他无脊椎动物的COⅠ基因序列研究结果一致[6-8]。红螯螯虾线粒体COⅠ区全序列中有变异位点24个，占分析位点的1.6%，变异位点中含有22个简约信息位点，平均转换与颠换的比值为6.14。彭刚等[5]比对6个养殖群体180个样本831 bp的COⅠ序列，发现变异位点56个，占总分析位点的6.7%，但简约信息位点只有16个，这可能是由于分析区域的不同所致。相对于颠换，转换不容易改变密码子编码的氨基酸。在基因组中，转换与颠换的比值约为2。在蛋白编码区，这个比值可以超过3。有研究表明，当转换与颠换的比值小于2时，基因的突变达到饱和状态[9]。

物种的遗传变异是适应生境的必要条件[10]，物种的遗传多样性与其生存、适应能力和进化潜力紧密相关。本研究从143个个体中定义了35种单倍型。其中，来自台湾的养殖群体的单倍型数量最多，且来自浙江、海南和台湾的养殖群体具有较多的共享单倍型(COⅠ-01、COⅠ02和COⅠ-03)。同时，这3种单倍型也是优势单倍型。来自江苏和安徽的养殖群体除了分别和其他养殖群体共有一个单倍型外，其余单倍型都为该养殖群体所独有。Grant等[11]认为，单倍型多样性大于0.5且核苷酸多样性大于0.005时，遗传多样性较高。在本研究中，5个红螯螯虾养殖群体的单倍型多样性范围为0.739～0.881，核苷酸多样性范围为0.001 88～0.005 20，其中，来自台湾的养殖群体具有相对较高的遗传多样性，但5个养殖群体整体呈现出高单倍型多样性和低核苷酸多样性的现状。这可能是由于红螯螯虾引种渠道有限，且大陆部分养殖群体系由台湾引进。依据Grant等[11]提出的4个群体扩张事件类型，本研究结果符合第2个群体扩张事件类型，即经历了瓶颈效应之后又产生了快速的群体扩张和核苷酸突变的积累。这与核苷酸不配对分布图显示的结果有所区别，可能是由所分析的红螯螯虾是养殖群体导致。来自江苏的养殖群体的单倍型多样性最低，来自安徽的养殖群体的单倍型多样性最高；来自台湾的养殖群体的核

A，整体；B，浙江；C，海南；D，台湾；E，江苏；F，安徽。A， Overall; B， Zhejiang; C， Hainan; D， Taiwan; E， Jiangsu; F， Anhui.图3 红螯螯虾5个养殖群体的核苷酸不配对分布图Fig.3 Nucleotide mismatch distribution of five cultured populations of C. quadricarinatus

苷酸多样性最高；来自浙江与江苏的养殖群体的核苷酸多样性相近。这些结果共同表明，所调查的5个红螯螯虾养殖群体具有不同的遗传多样性。

种群间的遗传差异是确定物种保护等级和管理单元的基础[12]。根井正利[13]认为，群体间的遗传距离为0～0.05。本研究中5个红螯螯虾养殖群体间的遗传距离为0.002 63～0.006 81。从遗传距离来看，来自浙江的养殖群体和来自海南的养殖群体的遗传距离最小，来自安徽的养殖群体与其他养殖群体的遗传距离较远。推测这种结果与亲本的引进渠道有关。来自浙江、海南和台湾的养殖群体具有较多的共享单倍型和较小的遗传距离，这可能是由于其交流频繁或有着同样的亲本来源。遗传分化系数作为衡量群体间遗传分化程度的重要指标，常用于评价群体遗传分化程度，在0～1的范围内，值越大，种群间的分化程度越高。一般评判标准是：<0.05代表轻度分化，0.05～<0.15代表中等分化，0.15～<0.25代表高度分化，0.25～1.00代表极高度分化[14]。以这个标准衡量，来自浙江的养殖群体与来自海南的养殖群体之间是轻度分化，与来自台湾的养殖群体是中度分化，与另外2个养殖群体是极高度分化。从系统发生树上也可以清晰地看到这一结果。调查的5个红螯螯虾养殖群体的线粒体COⅠ基因序列遗传差异AMOVA分析结果表明，遗传分化系数为0.342 1(P<0.01)，说明整个遗传变异中来自养殖群体间的占34.21%，其余均为来自养殖群体内的遗传变异。红螯螯虾在人工养殖情况下1 a即可达到性成熟，容易积累变异，但红螯螯虾是外来物种，引种渠道有限；因此，在基因交流较少的群体间虽然会产生一定的遗传分化，但遗传变异仍主要发生在群体内部。单倍型的分布差异是养殖群体间产生显著分化的主要原因[15]。

本研究基于线粒体COⅠ基因片段序列对5个红螯螯虾养殖群体的遗传多样性和结构进行了评估，发现不同养殖群体间的遗传多样性存在差异，养殖群体间存在着一定的基因交流。目前，GenBank中关于红螯螯虾线粒体的数据还不是很多，本研究的结果可为后续关于红螯螯虾遗传多样性变化的比较研究提供基础数据。