蛋用鹌鹑的VIPR-1基因的多态性与早期生长性状的关联分析

董智豪，陈 宇，黄高想，白俊艳，2，*，李静云，赵淑娟，2，雷 莹，2，王新乐，胡琦杭，范征宇

(1.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023； 2.洛阳市动物遗传育种重点实验室，河南 洛阳471023)

禽类已经成为日常生活的重要肉类食用品种，在科学工作者们的不懈努力下，我国培育出很多家禽新品系，无论是屠宰性能还是产蛋性能等方面都有极大的进步。在禽类生长性状这一块，很多研究者进行了关于生长性状方面的基因多态性测定，并找出影响禽类生长性状的如生长激素和生长激素受体(GH和GHR)基因[1-3]、黑素促黑素受体-4(MC4R)基因[4-6]、肌细胞生成素(MyoG)基因[7-9]、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因[10-13]等相关候选基因。血管活性肠肽I型受体(VIPR-1)基因是一种与Gs蛋白偶联的7次跨膜糖蛋白，具有大的亲水性胞外N-末端，随后是7个高度保守的疏水性跨膜螺旋和胞质C-末端。通过与腺苷酸环化酶偶联，促进细胞内cAMP的产生，属于促胰泌素/VIP受体亚族[14]。下丘脑-垂体-性腺轴对禽类的繁殖性具有高度的调控能力，该轴上的VIPR-1等基因被认为对家禽繁殖性能具有一定影响[15]。关于VIPR-1基因的其他研究也有很多，Zhou等[16]研究分析了VIPR-1基因的突变其对鸡育雏性状的遗传效应(亲子性)并得出该基因上的某些位点可能与亲子性有关。洪军等[17]采用如皋黄鸡作为实验材料，分析出VIPR-1基因的SNP位点与其产蛋性能和蛋品质之间具有一定关联，实验结果表明，等位基因T对产蛋性能和蛋品质的改善具有一定作用，GTTT和TTTTC组合基因型个体组合效应对产蛋性能更为显著。周敏等[18]通过克隆鹌鹑VIPR-1基因，再采用RT-PCR等技术获得了该基因的cDNA全长序列，后分析并检测出该基因在鹌鹑不同体组织中的表达规律，为鹌鹑的选育提供一定的理论依据。关于该基因对禽类产蛋性能的影响，Pu等[19]通过实验得出该基因多态性对鹌鹑蛋质量具有明显的影响。

目前我国对鹌鹑分子水平的研究工作虽处于一个上升阶段，但对蛋用鹌鹑基因多态性的研究还较少。有关VIPR-1基因多态性对家禽生长性状影响的研究较少，本研究从该点出发，分析VIPR-1基因多态性与其早期生长性状的关联程度，探究其是否能够作为鹌鹑早期生长性状的相关分子标记或者候选基因，对于研究鹌鹑分子遗传育种、提高其早期发育程度具有重要的理论意义和实践价值。同时，取得的实验结果可以用于鹌鹑品种的选育，以期在鹌鹑养殖业生产实践中获得更大的经济效益，为农户或厂家对于选用鹌鹑蛋用品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用的鹌鹑包括中国黄羽鹌鹑66只，中国白羽鹌鹑69只，朝鲜鹌鹑51只，均是从河南省养殖基地随机选取的母鹑。从每只心脏中采血2 mL，并装于肝素钠抗凝管中混匀后保存在-20 ℃的冰箱中。并测定体重(g)、胫长(cm)、胸宽(cm)、胸深(cm)、胸骨长(cm)、体长(cm)、胫围(cm)、日增重(g·d-1)、相对生长率(%)。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋用鹌鹑血液基因组DNA的提取

利用DNA试剂盒提取鹌鹑血液中基因组DNA，后放置在-20 ℃的冰箱中保存备用。

1.2.2 引物设计与合成

VIPR-1基因的引物信息来自蒲跃进[20]，引物由郑州鼎国生物有限公司合成。引物信息具体为，F：5′-GCTGCTGGTGGAAGGGTTA-3′，R：5′-CCGTCCAAGCAGTGATGAA-3′，片段大小为1 096 bp。

1.2.3 PCR-RFLP

本实验所采用的反应体系为10 μL，其中，0.6 μL的DNA，上、下游引物各0.4μL， 3.6 μL的去离子水，5 μL的2×TaqPCR Green Mix。PCR扩增程序为：在温度95 ℃进行预变性5 min；在95 ℃下变性40 s；在58.7 ℃的温度下退火45 s，72 ℃延伸35 s，进行35个循环；在72 ℃条件下延伸5 min。

VIPR-1基因外显子6-7的PCR产物采用HpyCH4IV酶进行酶切，其反应体系为10 μL：1×buffer 1.0 μL、PCR产物7.7 μL、限制性核酸内切酶HpyCH4IV(10 000 U·mL-1)0.3 μL、ddH2O 1.0 μL。混合均匀后，先置于37 ℃水浴锅内1 h，再置于将温度升至65 ℃水浴锅内1 h。然后利用2%的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行基因型测定。

1.3 统计方法

利用Excel和SPSS分析软件对所测得的数据进行合并整理，计算出VIPR-1基因的等位基因数，在所测鹌鹑群体中的基因频率、基因型频率、杂合度、有效等位基因数、多态信息含量，以及对所测群体的该基因进行哈代温伯格平衡检验。利用SPSS进行关联分析，分析模型为：Yijk=μ+Wi+Mj+eijk。式中：Yijk是表型测定值，μ是总体平均数，Wi是第i个周龄效应，Mj是第j个基因型效应，eijk是误差效应。

2 结果与分析

2.1 鹌鹑VIPR-1基因的PCR产物检测

中国黄羽鹌鹑、中国白羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑的VIPR-1基因的PCR产物检测结果见图1。由图1可以看出，电泳中的条带均在1 096 bp处，表明所扩增的PCR产物是目的基因。电泳条带单一无杂带，条带清晰无拖尾现象，可以用于后续的酶切实验。

2.2 鹌鹑VIPR-1基因的多态性检测

利用鹌鹑VIPR-1基因的引物进行混合DNA的PCR扩增并测序，在VIPR-1基因的外显子6到外显子7区域上共检测出15个SNP位点，分别为A94G、G97T、C201T、A204G、A233G、C260G、A299T、C354T、A355G、C378T、C407G、A425C、A543G、G585T、A586G。在所测出的15个SNP中的A355G位点可以被HpyCH4IV酶进行酶切，3个鹌鹑品种VIPR-1基因的酶切产物检测结果见图2-4，从图2-4可以看出，VIPR-1基因的HpyCH4IV位点(A355G)可以检测到AA(285 bp/811 bp)、AG(285 bp/811 bp/1 096 bp)和GG(1 096 bp)3种基因型，但是对于不同品种的鹌鹑种群来说检测到基因型种类也有所不同，其中中国黄羽鹌鹑和中国白羽鹌鹑检测到AA、AG、GG3种基因型，而朝鲜鹌鹑却只检测到AG和GG两种基因型，未检测到AA基因型。

M，Marker DL2000；1～2，中国黄羽鹌鹑；3～4，中国白羽鹌鹑；5～7，朝鲜鹌鹑。M， Marker DL2000；1-2， Chinese yellow quail;3-4， Chinese white quail; 5-7， Korean quail.图1 VIPR-1基因的PCR产物电泳检测结果Fig.1 Results of PCR products electrophoresis of VIPR-1 gene

M，Marker DL2000；1、2、3和6，GG基因型；4，AG基因型；5，AA基因型。M， Marker DL2000;1、2、3and 6， GG genotype;4， AG genotype;5，AA genotype.图2 中国白羽鹌鹑的VIPR-1基因酶切产物电泳图Fig.2 Electrophoretic map of restriction endonuclease products of VIPR-1 gene in Chinese white quail

M，Marker DL2000；1，AG基因型；2，GG基因型；3和4，AA基因型。M， Marker DL2000;1， AG genotype;2， GG genotype;3 and 4， AA genotype.图3 中国黄羽鹌鹑的VIPR-1基因酶切产物电泳图Fig.3 Electrophoretic map of restriction endonuclease products of VIPR-1 gene in Chinese yellow quail

M，Marker DL2000；1、2和4，GG基因型；3、5和6，AG基因型。M， Marker DL2000;1， 2and 4， GG genotype;3，5and6， AG genotype.图4 朝鲜鹌鹑的VIPR-1基因酶切产物电泳图Fig.4 Electrophoretic map of restriction endonuclease products of VIPR-1 gene inKoreanquail

2.3 VIPR-1基因的不同基因型的测序图谱

鹌鹑VIPR-1基因的不同基因型进行测序，获得的测序图谱见图5，从图5可以看出，鹌鹑VIPR-1基因的引物V2在HpyCH4IV位点(A355G)有一个A/G突变。

图5 鹌鹑VIPR-1基因HpyCH4IV位点(A355G)不同基因型的测序图谱Fig.5 Sequencing map of different genotypes of VIPR-1 gene HpyCH4IV (A355G) in quail

2.4 VIPR-1基因在鹌鹑群体中的遗传多态性

3个蛋用鹌鹑群体的VIPR-1基因的HpyCH4IV位点(A355G)的基因型频率、基因频率、杂合度、有效等位基因数等实验结果见表1。从表1中可以看出，中国黄羽鹌鹑和中国白羽鹌鹑含有AA、AG、GG 3种基因型，而且在中国黄羽鹌鹑和中国白羽鹌鹑中AG基因型频率最高，其频率分别达到0.636和0.609，远远超过这两个群体的其他两种基因型频率，在中国黄羽鹌鹑群体中AA基因型频率(0.227)略高于GG基因型频率(0.136)，而在中国白羽鹌鹑品种中结果相反。朝鲜鹌鹑中只检测到AG和GG两种基因型，其中GG基因型频率为0.765，远高于其AG基因型频率0.235。中国黄羽鹌鹑和中国白羽鹌鹑中A和G两个等位基因的基因频率较为相近，而朝鲜鹌鹑中两个等位基因的基因频率相差甚远。中国黄羽鹌鹑等位基因A的基因频率略高于等位基因G，而中国白羽鹌鹑和朝鲜鹌鹑的优势等位基因是G，G等位基因频率分别为0.609和0.882。

同样从表1中可以看出蛋用鹌鹑VIPR-1基因的HpyCH4IV位点(A355G)的群体遗传多态性，中国黄羽鹌鹑和中国白羽鹌鹑两者的杂合度分别为0.496和0.476，中国黄羽鹌鹑和中国白羽鹌鹑的遗传多样性略比朝鲜鹌鹑(0.208)的高。中国黄羽鹌鹑和中国白羽鹌鹑的有效等位基因数接近2，而对朝鲜鹌鹑来说，其有效等位基因数则只有1.262。VIPR-1基因的多态性在所测鹌鹑群体中并不高，其中VIPR-1基因在中国黄羽鹌鹑和中国白羽鹌鹑为中度多态(0.250.05)。

表1 蛋用鹌鹑VIPR-1基因多态性的群体遗传学分析Table 1 Population genetic analysis of VIPR-1 gene polymorphism in egg quails

2.5 鹌鹑VIPR-1基因与早期生长性状的关联分析

鹌鹑VIPR-1基因的HpyCH4IV位点(A355G)与1-4周龄生长性状的关联分析见表2，由表2可以看出，VIPR-1基因的HpyCH4IV位点(A355G)与中国黄羽鹌鹑的日增重、体重、胫长、胸宽、胸深、胸骨长、胫围有显著关联性(P<0.05)。具体表现为AA基因型个体的日增重、体重、胫长、胸宽、胸深、胸骨长、胫围显著高于GG基因型个体(P<0.05)，而AG基因型个体与AA基因型个体之间除胫围外无显著差异(P>0.05)。AG基因型个体的胸宽、胸深、胸骨长显著高于GG基因型个体(P<0.05)。

表2 鹌鹑VIPR-1基因多态性与1～4周龄生长性状的关联分析Table 2 Association analysis between VIPR-1 gene polymorphism and growth traits of 1-4 weeks inquails

相比较于中国黄羽鹌鹑，中国白羽鹌鹑和朝鲜鹌鹑受该基因多态性的影响要小得多。对于中国白羽鹌鹑来说，VIPR-1基因的HpyCH4IV位点(A355G)仅仅与胫围有显著关联性(P<0.05)，具体为AA基因型个体的胫围显著高于AG基因型和GG基因型(P<0.05)，而AG基因型和GG基因型的胫围无显著差异(P>0.05)。VIPR-1基因的HpyCH4IV位点(A355G)与其他生长性状无显著关联性(P>0.05)。

对于朝鲜鹌鹑来说，VIPR-1基因的HpyCH4IV位点(A355G)与体重、胸宽、胸深有显著关联性(P<0.05)，具体表现为AG基因型个体的体重、胸宽、胸深显著高于GG基因型个体(P<0.05)。VIPR-1基因的HpyCH4IV位点(A355G)与其他生长性状无显著关联性(P>0.05)。

鹌鹑VIPR-1基因的HpyCH4IV位点(A355G)与5-7周龄生长性状的关联分析见表3，由表3可以看出，对于中国黄羽鹌鹑来说，HpyCH4IV位点与鹌鹑的体重、胸骨长、胫长、体长、胸宽、胸深、胫围、日增重和相对生长率均有显著的关联性(P<0.05)。具体为HpyCH4IV位点的AA基因型个体的体重和胸骨长显著高于AG基因型和GG基因型个体(P<0.05)，而AG基因型和GG基因型个体的体重和胸骨长无显著差异(P>0.05)。AA基因型个体的胫长和体长显著高于GG基因型个体(P<0.05)，而AG基因型与GG基因型、AA基因型个体的胫长和体长无显著差异(P>0.05)。AA基因型和AG基因型个体的胸宽显著高于GG基因型个体(P<0.05)，而AG基因型与AA基因型个体的胸宽无显著差异(P>0.05)。AA基因型个体的胸深显著高于GG基因型个体(P<0.05)，而AG基因型与AA基因型、GG基因型个体的胸深无显著差异(P>0.05)。AA基因型个体的胫围显著高于AG基因型个体(P<0.05)，而GG基因型与AA基因型、AG基因型个体的胫围无显著差异(P>0.05)。GG基因型个体的日增重和相对生长率显著高于AG基因型个体，而AA基因型个体的日增重和相对生长率与GG基因型和AG基因型无显著差异(P>0.05)。

表3 鹌鹑VIPR-1基因多态性与5～7周龄生长性状的关联分析Table 3 Association analysis between VIPR-1 gene polymorphism and growth traits of 5-7 weeks inquails

HpyCH4IV位点与中国白羽鹌鹑的日增重和相对生长率均有显著关联性(P<0.05)，与其他生长性状无显著关联性(P>0.05)。具体为HpyCH4IV位点的AG基因型个体的日增重显著高于AA基因型个体(P<0.05)，而GG基因型与AG基因型、AA基因型个体的日增重无显著差异(P>0.05)。GG基因型个体的相对生长率显著高于AA基因型个体(P<0.05)，而AG基因型与GG基因型、AA基因型个体的相对生长无显著差异(P>0.05)。HpyCH4IV位点与朝鲜鹌鹑的体重有显著的关联性(P<0.05)，与其他生长性状无显著关联性(P>0.05)。具体为HpyCH4IV位点的AG基因型个体的体重显著高于GG基因型个体(P<0.05)。

3 讨论

3.1 VIPR-1基因的多态性

基因的多态性一般是指遗传的多态性，所以基因多态性就是在同一群体中，某个基因座上存在两个或两个以上的等位基因，且这些等位基因的频率大于0.01的现象，等位基因的形成和基因突变有关，其中环境的选择起着重要的作用，并且因为生长环境的不同，基因的多态性也越来越丰富，评价基因多态性的主要参数是基因频率、基因型频率等。在其他禽类上关于该基因多态性的研究有很多，Zhou等[16]在红原鸡等鸡品种中测出VIPR-1基因上的11 136 bp区域发现了128个变异位点，包括109个SNP和19个其他变异，通过所测数据计算得知，在鸡VIPR-1基因中，平均每102 bp产生1个SNP，在比较每个区域的SNP密度时，5′侧翼区域变异率最高，平均每83 bp产生1个SNP，然后内含子，平均每93 bp产生1个SNP。VIPR-1基因CDS的外显子2、外显子3和外显子6中有3个SNP，外显子2(A+457G)中有1个SNP改变了翻译成熟蛋白(Ser18Gly)。

蒲跃进[20]在神丹公司的H系、L系鹌鹑和河南南阳的野生鹌鹑3个品种VIPR-1基因的多态性研究中，VIPR-1基因外显子6和外显子7之间区域中发现到15个SNP位点，分别为A94G、A137C、A174G、C121A、A146G、A216G、A122G、A150G、C294C、A124C、A163T、A126T、A172G、A338G、A336G。我们在中国黄羽鹌鹑、中国白羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑这3个蛋用鹌鹑群体中也测到VIPR-1基因的外显子6到外显子7区域上共检测出15个SNP位点，分别为A94G、G97T、C201T、A204G、A233G、C260G、A299T、C354T、A355G、C378T、C407G、A425C、A543G、G585T、A586G。本研究检测的15个SNP中有些SNP的位置与蒲跃进[20]的略不同，这可能由于鹌鹑群体不同，也可能是测序的偏差造成的。

本研究对3个蛋用鹌鹑品种的VIPR-1基因外显子6-7的HpyCH4IV位点(A355G)进行酶切多态性分析，结果可以检测AA、AG、GG 3种基因型，3种基因型在不同鹌鹑群体中频率有所差异：在中国黄羽鹌鹑所测群体中基因型频率AA(0.227)、AG(0.636)、GG(0.136)，在中国白羽鹌鹑所测群体中基因型频率AA(0.087)、AG(0.609)、GG(0.304)，在朝鲜鹌鹑所测群体中基因型频率AG(0.235)、GG(0.765)。HpyCH4IV位点(A355G)在中国黄羽鹌鹑和中国白羽鹌鹑中以AG基因型频率最高，这与蒲跃进[20]研究的该位点在野生鹌鹑中AG基因型频率最高有相似结果。本研究中HpyCH4IV位点(A355G)在朝鲜鹌鹑中以GG基因型频率最高，这与蒲跃进[20]研究的该位点在H鹌鹑群体和L鹌鹑群体中GG基因型频率最高有相似结果。

3.2 VIPR-1基因与生产性能的关联分析

数量性状是受遗传(基因)与环境共同作用的影响，而且遗传(基因)对数量性状起着决定性作用，并且是遗传研究者更注重的研究课题。目前对VIPR-1基因的研究都是针对禽类繁殖性能方面的关联分析报道比较多，如周敏等[21]通过对宁都三黄鸡VIPR-1基因的多态性与其早期产蛋性能的关联分析，结果表明，选取的位于5’调控区和内含子6位点上的突变基因分别对该品种的产蛋量和开产日龄具有影响。但是，周敏等[22]在对鸡基因(VIPR-1)5’侧翼区上的两个SNP (A-1666G和G359T)与鸡产蛋性能的相关性，结果发现，这两个多态位点与鸡产蛋性能无显著影响。洪军等[17]研究表明，VIPR-1基因内含子2第+1063位碱基(PA位点)与如皋黄鸡的开产日龄(AFE)和40周龄总产蛋数(EN40)呈显著相关(P<0.05)。朱志明等[23]研究表明，VIPR-1基因外显子2的HpaⅡ位点与河田鸡的24日龄产蛋数、300日龄产蛋数有显著影响(P<0.05)。于海龙[24]研究表明，VIPR基因第3外显子的变异与连城白鸭500 d产蛋量存在显著关联(P<0.05)。

周敏等[25]探究清远麻鸡VIPR-1基因对其生长性状的影响，结果表明，该基因位点 C+53327T 与该鸡品种300日龄的体重呈极显著相关(P<0.01)，其中CT基因型个体300周龄体重显著高于CC和TT基因型个体。周敏等[26]在选用宁都三黄鸡的VIPR基因多态性与其鸡冠高度和体重做关联分析，分析得出其中内含子2和内含子8的突变基因对其体重具有一定影响。本研究主要分析了VIPR-1基因外显子6-7的HpyCH4IV位点对蛋用鹌鹑1～7周龄早期生长性状的影响，结果表明，VIPR-1基因的HpyCH4IV位点与中国黄羽鹌鹑的日增重、相对生长率、体重、胫长、胸宽、胸深、胸骨长、胫围有显著关联性(P<0.05)；HpyCH4IV位点与朝鲜鹌鹑的体重、胸宽、胸深有显著关联性(P<0.05)；HpyCH4IV位点与中国白羽鹌鹑的胫围、日增重和相对生长率有显著关联性(P<0.05)。本研究显示，HpyCH4IV位点(A355G)与中国黄羽鹌鹑和中国白羽鹌鹑的体重有显著关联性，这一结果与周敏等[25]、周敏等[26]的结果相似。综上，VIPR-1基因外显子6-7的HpyCH4IV位点(A355G)与蛋用鹌鹑的早期生长性状具有一定影响。但是由于本研究仅仅检测了VIPR-1基因外显子6-7区域上的位点，后期实验需要通过研究该基因片段上其余区域，进一步探究VIPR-1基因对鹌鹑早期生长性状的影响。