大黄及单体对金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用及作用机制研究*

徐令清,莫艳梅,简永欢，黎梓楠，何倩君,温伟洪,汤英贤,刘加伟,刘丽忠

广州医科大学附属第六医院检验科/清远市人民医院检验科,广东清远 511518

金黄色葡萄球菌是临床化脓性感染的重要病原菌之一，金黄色葡萄球菌是临床感染中最为常见的致病菌，可导致皮肤脓肿、肺炎、心膜炎、化脓性关节炎及菌血症等[1]。在细菌感染性疾病的治疗中，抗菌药物的应用一方面使许多严重的细菌感染性疾病得到有效控制；另一方面也使细菌的耐药性增强，临床上出现了大量多重耐药菌株。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有致病力强、传播速度快、常表现为多重耐药等特点,其耐药机制复杂，治疗难度大，病死率高。MRSA对β-内酰胺类抗菌药物耐药，并且对大环内酯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等抗菌药物多数耐药，导致抗MRSA感染药物的品种选择有限。因此，寻找新的抗MRSA的药物显得十分重要和迫切。相关报道显示，大黄对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强，大黄来源广泛，价格低廉，含有多种活性成分，对人体不良反应小，不仅能抗菌消炎，而且对金黄色葡萄球菌不易产生耐药性，这在临床上有很大的价值[2]。因此，大黄具有研究和开发的潜力，有广阔的应用前景，对改善多重耐药菌感染性疾病的治疗及有效对抗 MRSA 感染的药物有重要临床意义。

1 材料与方法

1.1菌株来源 选取广州医科大学附属第六医院(清远市人民医院)2019年检验科微生物室分离的80株金黄色葡萄球菌，包括MRSA 40株，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)40株。标准菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC 29213(微生物室保存菌株)。

1.2试剂与仪器 大黄(康美药业股份有限公司)；大黄单体：大黄酸-8-0-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄酚、芦荟大黄素、没食子酸、大黄酸、大黄素和大黄素甲醚(成都曼斯特生物科技有限公司)；血平板(江门市凯林贸易有限公司)；肉汤培养基与M-H琼脂平板(广州市迪景生物科技有限公司)；二甲基亚枫(DMSO)(天津市富宇精细化工有限公司)；96孔板(北京欣兴强森生物科技有限公司)；IFA-110T-8型微生物培养箱(艺思高科技有限公司)；DHP-9145A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；DensiCHEK Plus电子比浊仪(生物梅里埃美国股份有限公司)；VITEK2 Compact全自动微生物分析仪(法国生物梅里埃公司)；uLtiMate 3000型高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；DTT-A型电子天平(福州华志科学仪器有限公司)；酶标仪(德国BMG Spectrostar Namo全波长)。

1.3方法

1.3.1大黄混悬液和大黄单体溶液制备 称取大黄5 g置于离心管中，加入无水乙醇30 mL，进行萃取48 h，再将萃取液过滤挥干后，用无菌蒸馏水配制成256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg/mL共12种质量浓度。将8种大黄单体用DMSO分别配制成128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25 mg/mL 共10种质量浓度。均置于4 ℃保存备用。

1.3.2菌液制备 将菌株接种于血平板，37 ℃培养18 h，抑菌试验法(用生理盐水配制成0.5麦氏浊度)；最小抑菌浓度(MIC)测定法(用肉汤培养基配制成0.5麦氏浊度)，菌液浓度均为1.5×108cfu/mL。

1.3.3高效液相检测大黄组分 (1)样品提取：取5个锥形瓶，称取大黄各5 g置于5个锥形瓶中，分别加入丙酮、无菌蒸馏水、乙腈、甲醇和乙醇各100 mL，用封口膜把瓶口封好。超声提取30 min，用0.22 μm有机膜滤膜过滤到样品瓶中。(2)标准品溶液制备:分别精密称取8种单体1 mg，置于8个灭菌EP管中，各加入1 mL 的乙醇进行溶解。(3)高效液相色谱法检测：采用C18(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)色谱柱，流速为1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温35 ℃，进样量2 μL。流动相为乙腈水(50∶50)。分别对提取溶液和标准品溶液进行检测。

1.3.4大黄对3株金黄色葡萄球菌的抑菌作用 每种菌株取2个M-H琼脂平板，用无菌棉签蘸取0.5麦氏浊度菌液于平板上进行均匀涂布后，用无菌枪头扎7个孔。将12种质量浓度的大黄混悬液各10 μL加在平板周围6个孔中，平板中间孔加无菌蒸馏水作为对照。将平板置于37 ℃培养箱培养18 h。

1.3.5大黄8种单体对标准菌株的抑菌作用 每种单体取2个M-H琼脂平板，用无菌棉签蘸取菌液于平板上进行均匀涂布后，用枪头扎6个孔。将10种质量浓度的大黄单体溶液各10 μL加在平板周围6个孔中，平板中间孔加DMSO作为对照。将平板置于37 ℃培养箱培养18 h。

1.3.6大黄对80株金黄色葡萄球菌的MIC测定 于无菌96孔板中每孔加入肉汤菌液50 μL，第1个孔加入512 mg/mL大黄混悬液50 μL，采用微量倍比稀释法，使大黄混悬液质量终浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg/mL共12种质量浓度。将96孔板置于37 ℃培养箱培养18 h。

1.3.7大黄8种单体对标准菌株的MIC测定 于无菌96孔板中每孔加入肉汤菌液45 μL后加入10种质量浓度的单体溶液各5 μL(单体质量终浓度分别为12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05和0.025 mg/mL)，取肉汤菌液45 μL+DMSO溶液5 μL作为阳性对照，肉汤培养基50 μL作为阴性对照。将96孔板置于37 ℃培养箱培养18 h。

1.3.880株金黄色葡萄球菌药敏试验 采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪，使用配套的鉴定卡和药物敏感性卡进行细菌鉴定和药敏试验。

1.3.9标准菌株的生长曲线和DNA、RNA等大分子物质外渗水平检测 取培养至对数生长期的标准菌株，用无菌生理盐水配制成0.5 麦氏浊度，加入到含有大黄的肉汤培养基，使大黄质量终浓度为256 mg/mL。置于37 ℃培养箱培养。每隔2 h进行取样，取样时充分振荡，用酶标仪检测580 nm处的A值，以不加药作为对照，绘制生长曲线。DNA、RNA等大分子物质的检测每隔2 h进行取样，4 500 r/min离心10 min后，吸取上清液，用酶标仪检测260 nm处的A值，以不加药作为对照，绘制曲线。

1.4统计学处理 采用Excel 2010进行数据处理。

2 结 果

2.1大黄组分的检测结果 与标准品图谱比对后发现，大黄用丙酮萃取的色谱图出现5个色谱峰，表明有5种已知有效的成分被萃取出来。用无菌蒸馏水和乙腈萃取效果不明显，用甲醇和乙醇萃取的色谱图都出现9个色谱峰，表明都有9种已知有效成分被萃取出来，而且组分相似，由于甲醇有毒性作用，因此，选择乙醇作为溶剂对大黄进行萃取。大黄单体中大黄酸-8-0-β-D-葡萄糖苷和没食子酸的色谱图都没有出现色谱峰，可能是因为没有完全溶解，影响检测结果。大黄素-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素和大黄素甲醚都只出现一个色谱峰，说明溶解效果好，单体提取率高，大黄酸出现很相近的2个色谱峰，可能是同分异构体，说明纯度不是很高。

2.2大黄对3株金黄色葡萄球菌的抑菌作用 从培养箱取出平板，测量抑菌圈直径。大黄对3株金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用，大黄在质量浓度为8 mg/mL开始对标准菌株有抑菌作用，在质量浓度为32 mg/mL对MRSA和MSSA开始有抑菌作用。自32 mg/mL质量浓度起，大黄对MRSA的抑菌作用更明显，抑菌圈直径为19 mm。结果重复3次，取平均值。见表1。

表1 大黄对3株金黄色葡萄球菌的抑制圈直径测定结果(mm)

2.3大黄8种单体对标准菌株的抑菌作用 从培养箱取出平板，用尺子测量抑菌圈直径。8种单体中大黄酸-8-0-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄酚和大黄素甲醚对标准菌株没有抑菌作用，而芦荟大黄素、没食子酸、大黄酸和大黄素对标准菌株均有不同程度的抑菌作用，其中大黄素对标准菌株的抑菌效果最明显，抑菌圈直径最大，为20 mm,MIC为0.025 mg/mL。并且抑菌圈的直径还与单体浓度呈正相关，浓度越高，抑菌圈直径越大，抑菌效果越好。结果重复3次，取平均值，见表2。

表2 大黄8种单体对标准菌株的抑制圈直径测定结果(mm)

2.4大黄对80株金黄色葡萄球菌的MIC测定 大黄对40株MRSA 的最小抑菌浓度范围为16～128 mg/mL，MIC 50为32 mg/mL，MIC 90为64 mg/mL；大黄对40株MSSA的最小抑菌浓度范围为16～64 mg/mL，MIC 50为32 mg/mL，MIC 90为64 mg/mL。见表3、表4。

表3 大黄对80株金黄色葡萄球菌的MIC测定结果(株)

表4 大黄对40株MRSA和40株MSSA的MIC 50、MIC 90结果(mg/mL)

2.5大黄单体对标准菌株的MIC测定 经培养后，肉汤培养基澄清透明为无菌生长，混浊则为有菌生长，无菌生长的最低浓度称为MIC。大黄单体对标准菌株均有不同程度的抑菌作用，其中大黄素对标准菌株的抑菌作用最强，MIC为0.025 mg/mL，大黄酸抑菌效果次之。见表5。

表5 8种单体对标准菌株MIC测定结果(mg/mL)

2.680株金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药情况 鉴定结果均为金黄色葡萄球菌，记录80株金黄色葡萄球菌的药物敏感性数据并计算耐药率，40株MRSA抗菌药物中青霉素、苯唑西林、阿莫西林/克拉维酸的耐药率均为100.0%，见表6；40株MSSA抗菌药物中青霉素的耐药率(90.0%)最高，见表7。

表6 40株MRSA对10种抗菌药物的耐药情况[n(%)]

表7 40株MSSA对11种抗菌药物的耐药情况[n(%)]

2.7标准菌株的生长曲线和DNA、RNA等大分子物质外渗浓度 标准菌株金黄色葡萄球菌经过一定时间的迟缓期，开始迅速生长，在12 h进入平缓期，从4 h开始，大黄作用组的A值始终明显低于对照组，说明金黄色葡萄球菌生长明显受到抑制，见图1。大黄作用组的A值随着作用时间而升高，且大黄作用组的A值始终高于对照组，说明大黄作用后的金黄色葡萄球菌中 DNA、RNA 等大分子物质大量外渗，使培养基中的核酸等大分子物质浓度升高,见图2。

图1 标准菌株金黄色葡萄球菌生长曲线

图2 标准菌株的DNA、RNA等大分子物质外渗浓度检测结果

3 讨 论

金黄色葡萄球菌隶属于葡萄球菌属，常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中，空气、污水等环境中也无处不在，是最常见的医院和社区获得性致病菌之一，是仅次于沙门菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌[3]，近年来暴发流行，抗菌治疗方案有限，MRSA不仅对青霉素完全耐药，而且对红霉素、克林霉素、四环素均有很高(>70.0%)的耐药率；对环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、 庆大霉素、利福平的耐药株也广泛存在。多重耐药菌株的出现使MRSA已经成为院内感染的重要病原体之一[4-5]。本研究结果显示，在40株MRSA抗菌药物中青霉素、苯唑西林、阿莫西林/克拉维酸的耐药率均为100.0%，40株MSSA抗菌药物中青霉素的耐药率(90.0%)最高。近年来，众多国内外学者尝试从传统医学中寻找治疗MRSA的新思路。有研究发现，多种中药及其单体对MRSA 均具有良好的抑菌效果[6-10]。因此，寻找有效控制 MRSA 感染的药物势在必行。

大黄作为中国传统中药材，它在预防和控制细菌性感染疾病方面均发挥了积极作用。有研究表明，大黄具有较强的抗感染、抗衰老、抗氧化和增强免疫力等作用，它对多种革兰阳性和阴性菌均有一定的抑菌作用，其中最敏感的是葡萄球菌和链球菌，抗菌谱广[2]。大黄具备非特异性抗菌作用，并且能调节及提高机体免疫力，对细菌较难产生耐药作用。在初筛试验中，研究5种中药(大黄、黄连、五味子、连翘、黄芩)对金黄色葡萄球菌的抑菌作用表明，大黄对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最好。因此，本研究将探讨大黄不同成分对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，初步研究大黄不同成分对金黄色葡萄球菌抑菌的机制，为解决临床金葡萄球菌耐药提供新的依据，并为中药抑菌研究提供新的方向。

本研究选用了5种萃取溶剂(丙酮、无菌蒸馏水、乙腈、甲醇和乙醇)，这5种溶剂常用于大部分中药进行萃取。通过高效液相色谱仪检测，筛选出大黄的5种溶剂萃取物中组分较多的溶剂。5种溶剂中用无菌蒸馏水萃取的色谱图没有出现色谱峰，说明用无菌蒸馏水萃取效果较差。用丙酮和乙腈萃取的色谱图出现色谱峰不多，说明萃取效果也不是很好。而甲醇和乙醇萃取出较多的色谱峰，说明萃取出的物质较多，而且组分相似，由于甲醇有毒性作用，因此，选择乙醇作为溶剂对大黄进行萃取。本研究选用的大黄单体组分检测中大黄素-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素和大黄素甲醚都只出现单个色谱峰，说明溶解效果好，单体纯度较高。而大黄酸-8-0-β-D-葡萄糖苷和没食子酸的色谱图都没有出现色谱峰，可能是因为没有完全溶解，影响检测结果。大黄酸色谱图出现很相近的2个色谱峰，可能是同分异构体使用抑菌试验平板法筛选出对标准菌株金黄色葡萄球菌抑制效果较强的大黄单体，结果表明，芦荟大黄素、没食子酸、大黄酸和大黄素对标准菌株均有不同程度的抑菌作用。其中大黄素对标准菌株的抑菌效果最明显，抑菌圈直径最大，为20 mm，MIC为0.025 mg/mL。并且抑菌圈的直径还与单体浓度呈正相关，浓度越高，抑菌圈直径越大，抑菌效果越好。

本研究通过抑菌试验平板法研究大黄对3株金黄色葡萄球菌作用强弱，结果显示，大黄对MRSA的抑菌作用较明显。收集临床分离的80株金黄色葡萄球菌，检测大黄对80株临床分离的金黄色葡萄球菌的MIC，均表现出一定程度的体外抑菌作用，MIC值范围为16～128 mg/mL。本研究结果显示，芦荟大黄素、大黄素和大黄酸对金黄色葡萄球菌的抗菌效果较明显，而这3种大黄单体均为蒽醌类化合物，说明大黄的有效成分可能为蒽醌衍生物[11]。

本研究通过对标准菌株金黄色葡萄球菌生长曲线的检测说明大黄对金黄色葡萄球菌有抑菌作用，DNA、RNA等大分子物质外渗浓度检测证实大黄抑菌作用机制是能够破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜，导致菌体中DNA、RNA等大分子物质外渗，发挥抑菌作用。

周磊等[12]报道显示，大黄素可抑制金黄色葡萄球菌物质代谢中的关键酶(琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶)的活性而发挥杀菌作用。曹峰[13]研究认为，大黄素抗MRSA 效果明显，而且可破坏MRSA的细胞壁。刘明[14]研究认为，大黄素的抗菌机制与结合耐药蛋白、抑制β-内酰胺酶活性、增加药物在菌体内积聚无关。细菌的细胞膜是大黄素的作用部位，通过破坏细胞膜的完整性间接影响细胞壁合成，达到抗菌效果。

中药抗菌具有较好的前景，它作用于抗菌的各个环节，可直接作用于微生物本身，如破坏细菌细胞壁和细胞膜的完整性改变细胞通透性、抑制菌体内酶的活性、影响细胞蛋白质核酸的合成、抑制细菌生物被膜的形成等机制。

本研究中大黄对金黄色葡萄球菌的抑菌作用明显，这为临床采用大黄治疗由金黄色葡萄球菌引发的感染提供了依据，作用机制是通过破坏细菌细胞壁及细胞膜的完整性，关于其他的作用机制还有待进一步研究，以便更好地为临床治疗提供理论依据，将有助于在金黄色葡萄球菌感染中尝试应用大黄进行治疗，从而解决金黄色葡萄球菌的耐药问题[15]。对传统中药进行抗菌药物的发掘，将有助于发挥传统中药在临床抗感染中的应用。本研究为大黄的抗菌作用进一步研究奠定了基础，在细菌感染性疾病的治疗中有重要意义。