不明原因羊水过少孕妇胎盘组织中自噬体及自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达情况▲

张奕梅 宋鹏书 彭 晶 闭炳才 谭媛媛 黄飞燚

(广西壮族自治区妇幼保健院产科，南宁市 530003，电子邮箱：188950317@qq.com)

羊水是胎儿赖以生存的内环境，其既可保持子宫内温度恒定以利于新陈代谢，又可缓冲外界压力保护胎儿，使胎儿在宫内有一个适宜的活动空间，在胎儿发育过程中起着重要作用[1]。妊娠晚期羊水量少于300 mL者称为羊水过少，发生率为4%，羊水过少严重影响围生儿的预后，使围生儿相关疾病患病率、死亡率明显增加[2]。目前关于不明原因羊水过少的发生机制的研究报告较少，一般认为不明原因羊水过少的发生主要与胎盘功能有关[3]，而缺乏针对胎盘组织微观方面更为深入的研究报告。本文通过检测自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅱ、P62在不明原因羊水过少孕妇胎盘组织中的表达情况，探讨孕妇妊娠期不明原因羊水过少与胎盘发生自噬反应的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年3～8月于广西壮族自治区妇幼保健院分娩的30例不明原因羊水过少孕妇作为观察组，30例羊水量正常孕妇作为对照组。观察组纳入标准：(1)单胎，妊娠37～41周，孕妇年龄18～35岁；(2)B超检查提示羊水过少，即羊水指数≤5 cm或羊水最大暗区垂直深度≤2 cm。排除标准：(1)胎儿异常(包括染色体异常)、胎膜早破；(2)孕妇年龄≤18岁或≥35岁；(3)孕妇合并肝肾功能不全、甲状腺功能异常、糖尿病、高血压等心血管疾病；(4)存在妊娠高血压(子痫)、妊娠糖尿病等妊娠期并发症。对照组纳入标准：(1) 单胎，妊娠37～41周，孕妇年龄18～35岁；(2) B超检查提示羊水指数>5 cm或羊水最大垂直深度>2 cm。排除标准同观察组。入选本研究的孕妇对研究知情同意并签署知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 实验试剂 多聚甲醛固定液(Sigma公司，批号：P-6148)，LC3-Ⅱ单抗隆抗体(包含LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ；CST公司，批号：#4599)，P62多克隆抗体(SAB公司，批号：#13222)，β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司,批号：bs-0061R)，二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(博士德生物工程有限公司，批号：AR0146)；山羊抗兔荧光二抗(Jackson ImmunoResearch公司,批号：140987)，显影液(Bio-Rad公司，批号：#170-5060)。

1.3 样本采集 于胎盘娩出10 min内，避开明显梗死或钙化区域，于胎盘母体面中央快速取适量胎盘组织，用生理盐水将血液冲洗干净，用吸水纸吸干，放入-80℃冰箱冻存备用。

1.4 透射电镜观察胎盘组织中的自噬体 用生理盐水冲净胎盘组织血液，将胎盘切成大小约1 mm3的组织块放入EP管，加入3%戊二醛缓冲固定液(北京百奥莱博科技有限公司，批号：BTN160240)固定2 h，PBS缓冲液冲洗，向样品中加入2%四氧化锇缓冲固定液(上海硕光电子科技有限公司，批号：P0011841)进行后固定; 用梯度乙醇对样品进行梯度脱水;丙酮置换样品中乙醇，然后进行环氧树脂渗透，包埋，聚合，切成0.5 mm×0.3 mm面积大小的薄片，然后使用醋酸铀和柠檬酸铅进行电子染色，在透射电子显微镜(日本电子株式会社，型号：JEM-2100)下观察细胞中自噬体变化。

1.5 免疫印迹试验检测胎盘组织中自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ、P62的表达 取0.1 g胎盘组织，用生理盐水洗净组织表面的血迹，称重后剪碎组织放入EP管中，用电动匀浆机研碎，加入组织裂解液，放在冰盒上裂解40 min，然后在4℃、3 500 r/min、离心20 min，提取组织总蛋白，使用二喹啉甲酸法检测蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品蛋白，120 mA恒定电流将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜，脱脂奶粉室温下封闭30 min，TBST冲洗3次，5 min/次。加入一抗(LC3和P62的稀释比例为1 ∶500，β-actin为1 ∶1 000),4℃摇晃孵育过夜,TBST冲洗3次，5 min/次，加入二抗(1 ∶8 000)室温孵育1 h，TBST冲洗3次，5 min/次，显影液显色。结果用凝胶成像分析软件处理，计算各组目的蛋白相对表达量，实验独立重复3次采取均值。

1.6 免疫组化检测胎盘组织中自噬蛋白LC3-Ⅱ、P62的表达 取大小约1 cm3的胎盘组织块，用生理盐水漂洗血液，置于4%的多聚甲醛缓冲固定液中固定24 h。然后组织块脱水，石蜡包埋，切成4 μm厚度薄片，放入37℃温水表面让切片充分伸展后贴到载玻片上，再依次浸入二甲苯、乙醇脱掉切片表面的蜡层。高压修复，3%双氧水中孵育。用PAP笔在组织切边画圈，然后滴加封闭液。一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育20 min，二氨基联苯胺显色5 min。苏木素染色1 min，分化反蓝，梯度乙醇脱水，树胶封片，在显微镜下观察阳性面积(黄棕色区域)大小。实验独立重复3次并如实记录。

1.7 苏木精-伊红染色观察两组胎盘组织的病理学差异 取大小约1 cm3胎盘组织块，用生理盐水漂洗血液，置于4%的多聚甲醛缓冲固定液中固定24 h。然后组织块脱水，行石蜡包埋，切成4 μm厚度薄片，放入37℃温水表面让切片充分伸展后贴到载玻片上，再依次浸入二甲苯，乙醇脱掉切片表面的蜡层。蒸馏水冲洗，然后将载玻片放入苏木精溶液中染色，流水冲洗，放入37℃温水中反蓝，晾干，中性树胶封固保存，在显微镜下观察染色情况，实验独立重复3次并如实记录。

1.8 统计学分析 数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用成组t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组胎盘组织中的自噬体 通过透射电镜观察发现，与对照组正常胎盘组织内部细胞器结构相比，观察组胎盘组织中存在大量双层膜的自噬体和单层膜结构自噬溶酶体，其中包裹变性坏死的细胞器和部分蛋白质，见图 1。

对照组 观察组

2.2 两组胎盘组织中自噬蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达 免疫印迹试验检测结果显示，与对照组相比，观察组胎盘组织中LC3-Ⅱ 的相对表达水平升高，P62蛋白的相对表达水平降低(均P<0.05)，见表1和图2。 免疫组化检测结果显示，与对照组相比，观察组的LC3-Ⅱ蛋白阳性表达区域明显增多，但是P62蛋白阳性表达区域减小，与免疫印迹试验实验结果一致，见图3。

表1 两组胎盘组织中自噬蛋白LC3-Ⅱ和P62相对表达水平的比较(x±s)

图2 两组胎盘组织中LC3-Ⅱ和P62蛋白的表达情况

图3 两组胎盘组织中 LC3-Ⅱ和P62蛋白的表达情况(免疫组化染色，×400)

2.4 两组胎盘组织的病理学结果 苏木精-伊红染色结果显示对照组的胎盘组织内部细胞排列整齐，绒毛组织几乎无破损，而观察组的胎盘组织内部出现细胞溶解，胎盘组织中的血管有水肿破裂，见图4。

图4 两组胎盘组织苏木精-伊红染色结果(苏木精-伊红染色，×200)

3 讨 论

羊水对维持胎儿正常的生长发育具有重要的作用，羊水过少是产科常见的妊娠期并发症，其发生率为4%[4]。羊水过少的胎儿可因脐带受到挤压，发生宫内缺氧、缺血及窒息。有研究结果显示，当羊水量少于50 mL，围产儿病死率高达88%[5-6]。羊水过少的原因有胎儿结构异常、羊膜病变、母体因素等，但部分羊水过少的病例临床原因不明，因此值得进一步深入研究。

自噬是一种保守的细胞自我降解方式，当组织或细胞发生炎症和受到不良刺激时就会发生自噬反应，通过自噬溶酶体吞噬自身受损的胞质或细胞器达到细胞内营养和能量再利用的目的[7-8]。孙晓东等[9]发现通过白藜芦醇诱导细胞发生自噬性死亡，可抑制宫颈癌的发生、发展，提示干预细胞自噬性死亡为癌症的治疗提供很好的思路，但是在妊娠期，细胞自噬反应过度会产生一系列不良影响。近年来有研究表明，自噬可在受精卵着床、胎盘形成和分娩多个过程中影响妊娠[10]，其在妊娠过程中发挥重要的作用，但细胞自噬反应过度也会导致不良妊娠并发症的发生，如子痫前期、妊娠期糖尿病、胎儿生长受限等。夏炳章等[11]发现子痫前期的发生是由于缺氧环境下，细胞氧化应激作用增强，可能通过过度自噬反应而损伤胎盘绒毛结构，导致胎盘发育不全。然而，自噬是否与不明原因羊水过少发生有关，目前仍无相关研究报告。投射电镜是检测细胞自噬的金标准，本研究中，在投射电镜下发现不明原因羊水过少孕妇的胎盘组织中自噬体与自噬溶酶体的数量多于正常胎盘组织，因此推断羊水过少可能与自噬体数量增加有关。但细胞自噬是一个循环动态过程，因此自噬体数量并不能说明自噬水平的高低[12]。而LC3-Ⅱ、P62是自噬关键性的蛋白，在自噬体形成中发挥重要的作用，可直接反映自噬水平，其中LC3-Ⅱ的表达含量与自噬反应呈正相关，而P62的表达含量与自噬反应呈负相关[13-14]。因此，我们进一步检测了胎盘组织中LC3-Ⅱ、P62的表达情况，结果显示，羊水过少者的胎盘组织中LC3-Ⅱ蛋白表达水平高于正常胎盘组织，P62蛋白表达水平低于正常胎盘组织，这说明羊水过少的胎盘组织中存在自噬反应过度现象。

自噬是一把双刃剑，在缺氧微环境下，细胞自噬的主要作用是避免损伤的内皮细胞发生细胞凋亡，从而保护血管内皮细胞功能；当细胞自噬水平过高时，会损伤细胞内正常的细胞器组织，导致细胞发生自噬性死亡[15]。为了验证羊水过少与细胞自噬反应之间的关系，我们对两组胎盘组织进行HE染色后观察病理学变化，发现正常孕妇的胎盘组织内部细胞排列整齐清晰，而羊水过少孕妇的胎盘组织中出现细胞溶解和血管水肿破裂。由此推断，自噬反应过度导致细胞中细胞器损坏严重，致使细胞死亡，最终发生胎盘病变间接导致羊水减少。

综上所述，不明原因羊水过少的发生机制之一可能是胎盘组织中细胞自噬反应过度致使细胞发生自噬性死亡，血管组织发生破损，最后导致胎盘组织发生病变致使羊水减少。但本研究没有进一步分析相关信号通路导致胎盘组织发生过度自噬反应的机制，这将是今后的研究方向。