一种金黄色葡萄球菌快速MPN检测法及其方法比对研究

金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌之一，由其引发的食物中毒事件屡见不鲜，国家食品安全标准《GB 29921-2013》将其列为食品中最常见的五种致病菌之一，并要求使用平板计数法（涂布法）进行检测。然而实际工作中往往会遇到一种情况，当样品中目标菌浓度很低而背景菌浓度很高，低稀释倍数下其目标菌会被大量的背景菌覆盖，导致后续无法挑取目标菌菌落，而若提高稀释倍数，则无法培养出目标菌落。此时，MPN计数法更能够准确地反映出此类样品中金黃色葡萄球菌的污染程度，因为MPN体系拥有高数量的平行管、小于十倍的稀释倍数、更适宜的生长条件以及便于解释和弥补的重复误差。不过，国标中的MPN计数法也有其不足之处。第一，划线分离和挑取可疑菌落的工作量大，划线分离一个样品就需要划9块BP平板，倘若有可疑菌落，每块BP平板又需要挑5个可疑菌落做确认实验，等于一个样品最多要做45个兔血浆凝固酶实验。第二，仅仅9管的MPN法，其准确性受到限制。MPN法的准确性取决于做的管数，管数越多，准确性就越高，但增加管数也就意味着更多的工作量、更高的检测成本，这可能就是“限量标准”中不使用MPN法的原因之一。

本文介绍了一种快速的金黄色葡萄球菌MPN检测法（以下简称“快速MPN检测法”），可以大幅缩短检测周期，节约企业检测成本，还可以提高检测准确性。

一、材料

7.5%Nacl肉汤，广东环凯;1%亚碲酸钾溶液，青岛海博;兔血浆（RPFA）纤维蛋白原琼脂，Bioker;Baird-Parker（BP）琼脂，广东环凯;冻干兔血浆，广东环凯;脑心浸出（BHI）液肉汤，青岛海博;96方孔板，2.2ml;金黄色葡萄球菌菌种，CICC 21600。

二、方法

1.快速MPN检测法操作步骤。（1）检样制备。取25g（ml）样品，放入盛有225ml7.5%氯化钠-亚碲酸钾肉汤（每1000ml7.5%氯化钠肉汤中加入1ml1%亚碲酸钾溶液）的均质袋内，用拍击式均质器均质1min，混合均匀，制成1︰10的样品均液。在7.5%氯化钠肉汤中加入亚碲酸钾的目的有两个，一是亚碲酸钾可以抑制非葡萄球菌的细菌生长，增加增菌时的选择性;二是金黄色葡萄球菌能够还原亚碲酸钾产生黑色沉淀，方便结果观察。（2）稀释。取1︰10的样品均液1.0ml，加入7.5%氯化钠-亚碲酸钾肉汤9.0ml，涡旋混合均匀，制成1︰100的样品均液。按此方法制备十倍系列稀释样品匀液。（3）加样。选择3个适宜稀释度，每个稀释度在96方孔板中接种3孔。接种的孔数和稀释度可以增加，此处接种3孔和3个稀释度是为了与国标法做比对。（4）培养。将接种后的96方孔板放入36±1℃的恒温培养箱，培养18-24h。（5）接种。反复振荡96方孔板，然后用接种针蘸取底部变黑或疑似底部变黑的孔中培养物，穿刺接种于RPFA平板，每孔至少穿刺5次。将穿刺后的RPFA平板放入36±1℃的恒温培养箱，培养6-24h。金黄色葡萄球菌能够使RPFA中的兔血浆凝固，从而使菌落周围出现乳白色沉淀环。（6）结果判断。接种的RPFA平板上出现乳白色沉淀环的孔标记为金黄色葡萄球菌阳性孔。按金黄色葡萄球菌阳性孔数，检索MPN表或使用MPN计算软件，得到每g（ml）样品中的金黄色葡萄球菌数。

2.国标MPN检测法操作步骤。按照《GB 4789.10-2016/第三法金黄色葡萄球菌MPN计数法》进行。

3.分析方法。（1）相对精度（relative trueness）分析。选择4种常见的检测金黄色葡萄球菌的食品样品，用金黄色葡萄球菌标准菌株分别进行人工污染，分别按照国标MPN检测法和快速MPN检测法进行检测。每种样品检测5次，用所有4种样品的5次平行数据绘制散点图，其中不同种的样品用不同的形状表示，并画出两种方法对每个被分析样本得出相同结果时的直线，这样可以快速直观地评估这两种方法不一致的程度。计算每对数据的平均值和每对数据值之间的差异，并按样品种类对所有参数绘制Bland-Altman一致性分析图，从而直观地说明数据的偏倚程度和一致性程度。（2）精度曲线（accuracy profile）分析。精度曲线用于检查快速MPN检测法与国标MPN检测法产生的结果相差是否小于某个可接受标准值，这个可接受标准值在本文中设置为±0.5log10单位，也可以通过方法使用者与最终用户之间达成的共识来决定。用6份含低中高浓度的人工污染样品（全脂奶粉）检测数据绘制精度曲线，以此比对两种检测方法在乳制品检测中的一致程度。（3）凝固酶实验灵敏度初探。快速MPN检测法用穿刺接种RPFA替代传统转接兔血浆来确定菌株是否含有凝固酶，考虑到穿刺法接种的接种量远不及传统法的接种量，为验证穿刺接种的有效性，需对其做灵敏度验证。将金黄色葡萄球菌接种至BHI肉汤，在36℃条件下培养24h后，使用GB 4789.2-2016对其计数。分别用100、101、102、103、104级稀释液穿刺RPFA，同时接种7.5%氯化钠-亚碲酸钾肉汤，在36℃条件下接种24h后再次穿刺接种RPFA。

三、结果与分析

1.相对精度分析结果。根据四种样品经人工污染后通过两种方法检测的结果（结果取对数），全脂奶粉的平均差值为0.39，差值标准偏差为0.27;速冻水饺的平均差值为0.40，差值标准偏差为0.21;猪肉香肠的平均差值为0.22，差值标准偏差为0.10;三文鱼片的平均差值为0.27，差值标准偏差为0.15。具体数据详见表1，再将其绘制成散点图和Bland-Altman一致性分析图，详见图1和图2。由散点图（图1）可见，无明显偏离等差线（y=x）的结果点出现，说明两种方法得出的检测结果没有出现极端的差异;由Bland-Altman一致性分析图（图2）可见，仅有一个结果差异点出现在95%下限之下，说明两种方法得出的检测结果的差异具有很大程度上的一致性。

2.精度曲线分析结果。6份中低高不同染菌量的全脂奶粉，用两种检测方法同时检测5个平行后，得到的检测结果见表2。将其绘制成精度曲线图，见图3。由精度曲线图（图3）可见，两种方法得出的检测结果的差异均在所设的可接受极限（AL）内，说明两种方法产生的结果差异性可接受。

3.凝固酶试验灵敏度初探分析结果。（1）当菌液含菌量少于104CFU/mL时，直接穿刺RPFA后有部分接种点无菌落生长。当菌液含菌量在104CFU/mL以上时，所有接种点均有菌落生长，并且全部能够产生凝固酶反应。也就是说，只要7.5%氯化钠-亚碲酸钾肉汤管中的金黄色葡萄球菌能够达到104CFU/mL，快速MPN检测法即可检测出阳性结果。（2）将100、101、102、103、104级稀释液接种7.5%氯化钠-亚碲酸钾肉汤，在36℃条件下接种24h后穿刺RPFA，所有接种点均发生凝固酶反应。也就是说，当样品中的金黄色葡萄球菌含量低至个位数时，经快速MPN检测法增菌后依然可以检出阳性结果。

四、结论与讨论

本文介绍了一种食品中金黄色葡萄球菌快速MPN检测法，其优点是检测周期短，相比国标法可以缩短24小时，并且操作步骤简单，省去了划线分离等步骤。在与国标金黄色葡萄球菌MPN法的方法比对研究中，通过相对精度分析和精度曲线分析可以非常直观地看出，两种方法对常见的几种食品中金黄色葡萄球菌的检测结果具有高度一致性。由于本方法操作简单，非常适合增加检测管数，检测管数越多，结果准确性就越高，值得推广使用。

本文中凝固酶试验灵敏度分析虽然是对本方法中凝固酶试验灵敏度的初步研究，但却证明了该方法的可行性，由于作者个人精力有限，未能在整体方法的灵敏性、特异性、包含性、排斥性等方面一一展开论述，欢迎对此感兴趣的人士一起参与研究，一起为祖国的检测行业贡献一份力量。

作者简介：凌超（1989-），男，上海，本科，工程师，研究方向：食品检测。