褐藻胶裂解酶研究进展

栾明鉴，何熹，林荣芳，姚艳艳，赵祥忠

1. 齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院（济南 250353）；2. 齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院（济南 250353）；3. 威海长青海洋科技股份有限公司（威海 264200）

褐藻是中国重要的经济藻类之一，也是沿海地区重要的生物能源制造者，有超过250个属，1800余种[1]。目前应用最多的是琼胶、褐藻胶和卡拉胶。其中，褐藻胶在海藻工业中产量最大、品种最多、用途最广，被广泛应用于各种工业。褐藻胶的降解产物褐藻胶寡糖也具有许多生物活性，因此近年来受到许多科研工作者的极大关注[2]。

我们通常所指的褐藻胶是褐藻酸的钠盐——褐藻酸钠，又名海藻酸钠，广泛存在于各种褐藻中的一类水溶性酸性多糖物质。褐藻酸钠分子式为（C6H7O8Na）n，是由β-D-甘露糖醛酸（M）与α-L-古罗糖醛酸（G）两种基础物构成，通过β-1, 4-糖苷键相连接[3]。相对分子质量在33～250 K之间，一般为白色或淡黄色粉末，无臭无味，不溶于乙醇、乙醚、氯仿和酸（pH＜5.4），易溶于碱水，吸水膨胀变软，成黏稠状胶体。

褐藻胶是褐藻细胞壁的重要组分，具有分子质量大、高聚合度、高黏度及高纤维性等特征，因而人体吸收利用程度差，很大程度上限制了使用范围[4]。人们通过科学的方法将其分解，变成可吸收利用的有效成分。褐藻胶的降解产物——褐藻胶寡糖所具有的免疫调节、抑菌、抗病毒能力等生物活性，在医药界具有很大的潜在价值。褐藻胶寡糖属于低分子聚合物，是由2～10个单糖通过糖苷键结合而成的，具有溶解性好，稳定性强，易被机体吸收且安全无毒等特点[5]。目前有大量文献对褐藻胶寡糖进行了深入研究和开发，使其更多的活性应用到食品、药品、环保、化工领域中，因此具有很高的应用价值[6]。

褐藻胶裂解酶作为生产褐藻胶寡糖的工具酶，反应效率高，反应条件温和，可控性强，便于定向制备褐藻胶寡糖，其研究具有深远理论意义和应用前景。

1 褐藻胶裂解酶及其酶解特性

根据目前的研究结果，褐藻胶制备AOS方法分为三种：物理方法，化学方法和生物酶解方法。物理方法主要有辐射降解，热液降解等。降解程度与温度和时间呈正相关。缺点是降解的产物相对分子质量大，较难获得具有生物活性价值的褐藻胶寡糖。化学方法主要有酸水解、碱水解和氧化水解。但是化学方法不容易控制，耗时长，褐藻胶被降解到一定程度后，副产物多，降解产物浓度低，很难再进一步降解。而利用褐藻胶裂解酶，可大大提高低聚糖片段的产率，绿色环保。现如今酶解法将逐渐取代传统的化学降解法[7-8]。

褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶（Polysaccharide Lyase，PLs）的一类，褐藻胶裂解酶分布于PL家族5，6，7，14，15，17，18的7个家族中。褐藻胶裂解酶还可根据酶切位点分为内切酶和外切酶两种，大部分为内切酶。多数报道发现褐藻胶裂解酶多为poly M偏好型，少数为poly G偏好型。虽然褐藻胶裂解酶存在降解poly M或者poly G的偏好性，但不代表其不能降解非特异性的底物[9]。

褐藻胶裂解酶通过β-消除机制（β-eliminate），作用于单体间的1-4糖苷键，随着糖苷键的消除，产物末端六元环C4和C5位会生成不饱和双键，底物的非还原性末端也会生成不饱和4-deoxy-L-erythro- hex-4-enopyranosyl糖醛酸，从而使得褐藻胶降解成一系列长短不一的寡糖片段。其酶解机理如下图所示。不论是D-甘露糖醛酸或L-古罗糖醛酸都可生成不饱和衍生物。不饱和糖醛酸在235 nm波长处有强烈的紫外吸收，因此酶活力大小可在此波长处进行测定。

图1 褐藻胶裂解酶作用原理图

2 影响褐藻胶裂解酶活性的因素

2.1 褐藻胶裂解酶来源

褐藻胶裂解酶的来源有很多，细菌与真菌中都存在，但大多数存在于细菌中，常见的有海洋弧菌，交替假单胞菌，盐单胞菌，黄杆菌属等。目前已有50多种褐藻胶裂解酶从藻类、海洋软体动物以及土壤细菌中分离出来[10]。李婷婷等（2017）研究发现，以海藻酸钠为唯一碳源，从天然腐烂海带中筛选得到一株高效褐藻胶降解菌株53#，经形态学观察和16SrRNA鉴定，确定为类芽抱杆菌Paenibacillus agaridevorans。采用正交试验方法，以pH、温度、NaCl浓度和海藻酸钠初始浓度为影响因素，对该菌株的产酶条件进行优化，得到53#菌的最佳产酶条件：pH 8，25 ℃，NaCl质量浓度15 g/L，海藻酸钠初始浓度15 g/L。在最佳产酶条件下，褐藻胶裂解酶达到最大酶活。筛选得到的类芽抱杆菌Paenibacillus agaridevorans53#具有易于培养、产酶速度快和酶活力高等优点，能够实现褐藻胶的高效糖化，在褐藻生产生物乙醇领域具有潜在利用价值[11]。然而周敏[12]研究发现以褐藻酸钠为唯一碳源，从海带降解菌群、海螺、鲍鱼内脏中共筛选出褐藻胶裂解酶产酶菌株共7株，其中鲍鱼内脏来源的弧菌属细菌Vibriosp. B4.活性最高。对Vibriosp. B4产褐藻胶裂解酶的发酵条件和发酵培养基进一步优化，获得发酵培养基的最适碳源为褐藻酸钠10 g/L，最适氮源为硫酸铵10 g/L，最适发酵条件为温度30 ℃，接种量1%，培养基初始pH 6.0。因此可见，由于菌种的不同，培养条件不同，酶活也不尽相同。

2.2 培养条件的优化

培养条件、接种量、接种龄、培养基的各成分配比都会影响酶活性。李双等[13]以交替单胞菌属新种HB161718为研究菌株，在单因素试验基础上，通过Box-Behnken设计及响应面法优化获得该菌的最佳产酶培养基：海藻酸钠7.23 g/L，蛋白胨7 g/L，NaCl 23.11 g/L，K2HPO40.1 g/L，MgSO40.1 g/L，优化条件下酶活力达到优化前的1.59倍。

褐藻胶裂解酶在常温、常压和温和的酸碱环境下，可以进行高效的催化反应。褐藻胶裂解酶本身是蛋白质，无毒，对酸碱度敏感，故可通过调节反应环境酸碱度、改变反应环境温度或添加抑制剂（助力剂）的方法控制酶促反应进行。pH、金属离子、温度等因素，对于酶活有显著影响。杨锦等[14]发现适合浓度的Mg+、K+、Fe2+对产酶起到了促进作用，这与之前的研究结果相一致。此外，菌株SH-1几乎不能在无 K+的培养基中生长和产酶，表明K+是其生长和产酶所必需的无机盐。Microbulbifersp. SH-1适宜生长的条件为pH 7～8.5，温度25～32 ℃，最适产酶条件pH 7.5，温度32 ℃，该条件温和可控易于实现。

3 褐藻胶裂解酶分子生物学研究

决定酶活性的两个关键性因素，一个是足够的酶表达量，另一个是酶的结构决定单位酶活性。足够的酶表达量，可以利用分子生物学的方法，将不同生物的褐藻胶裂解酶基因进行过量异源表达最为常见。其中大肠杆菌和毕赤酵母是最常见的模式菌株。酶的单位活性可以通过研究催化机制，改造蛋白质结构，进而提高酶的活性。

由于定向改造后的产酶菌株适合于工业发酵，可以满足市场对该酶的需要，具有较大的发展前景。随着分子生物学技术的蓬勃兴起，为褐藻胶裂解酶研究提供了新的技术手段。通过基因工程技术、异源表达、蛋白质结构改造等方法对褐藻胶裂解酶进行改造，设计适用于不同工业化应用的褐藻胶裂解酶生产菌株。

3.1 褐藻胶裂解酶基因表达研究

近年来，在NCBI数据库中已收录多种来源的褐藻胶裂解酶基因。Masayuki等[15]在PL-7家族中，发现铜绿假单胞菌基因组中存在一个编码与藻鞘氨醇单胞菌裂解酶A1-II同源的蛋白（PA1167）的基因。在大肠杆菌中过表达的PA1167产物降解褐藻酸钠并释放了不饱和糖。Zhu等[16]从深海细菌Flammevirgasp.中克隆并鉴定了一种新型的双功能褐藻胶裂解酶FsAlgB。重组FsAlgB的特征是内切褐藻胶裂解酶，它可以识别四糖为最小底物并切割相关亚位点之间的糖苷键。在菌种中发现新的基因并克隆表达，是现阶段褐藻胶裂解酶的基础研究。

Yang等[17]从Microbulbifersp. Q7克隆了编码新褐藻胶裂解酶AlyM的基因alyM并在大肠杆菌中表达。AlyM在pH 7.0和55 ℃时表现出最大的活性，并且特别偏爱聚古洛糖醛酸（polyG）。ESI-MS分析表明，AlyM主要产生聚合度（Degree of polymerization，DP）为2-5的寡糖。Li等[18]在Flavobacteriumsp. H63中发现褐藻胶裂解酶基因sag I，并对其进行密码子优化，成功在毕赤酵母中高效表达。酵母培养上清液中sagI重组酶（rSAGL）的最高产量达到226.4 μg/mL（915.5 U/mL）。该酶的最佳反应温度和pH为45 ℃和7.5。Yang等[19]构建重组褐藻胶裂解酶cAlyM及其热稳定突变体102C300C，并在毕赤酵母中成功表达，鉴定结果显示出两种酶具有很好的热稳定性，两种酶在50 ℃和pH 8.0时均表现出最大活性，并且对polyG偏爱。大肠杆菌和毕赤酵母均为模式生物，但在这两种不同的微生物系统表达中，由于过量表达而未及时折叠成有活性的结构，形成包涵体，酶活将受到不同程度的影响。这也是目前研究中遇到的难题之一，包涵体的解决，可以极大地提高异源表达的成功率。

3.2 褐藻胶裂解酶蛋白质结构研究

近年来随着结构生物学的发展，越来越多褐藻胶裂解酶的结构及催化机制得到解析。从结构上来看，褐藻胶裂解酶通常采取3种结构：β果冻卷、（α/α）n桶状结构和β螺旋结构。褐藻胶裂解酶通过β消除的方式来降解褐藻胶，根据催化过程中有无金属离子的辅助，褐藻胶裂解酶的催化机制又可进一步分为His（Tyr）/Tyr型β消除和金属离子辅助的β消除。这一理论为褐藻胶裂解酶的应用提供一定的理论依据[20]。对蛋白质结构进行定向定点的改造，可以解决褐藻胶裂解酶的低热稳定性等一系列的问题。Yang等[21]研究发现，在这项研究中，引入二硫键，可以提高MicrobulbiferspQ7的褐藻胶裂解酶cAlyM的热稳定性。与cAlyM相比，设计的两种突变体，在45 ℃的半衰期分别增加2.25 h和1.16 h，并且在融解中分别增加1.7 ℃和0.4 ℃。这项研究中使用的合理设计策略，为提高褐藻胶裂解酶的热稳定性，提供了一种有价值的方法。Emil等[22]从肠道细菌Bacteroides cellulosilyticus（BcelPL6）细菌中提取了6家族的褐藻胶裂解酶，将保守的催化位点残基Lys249，Arg270和His271进行取代，导致活性丧失。Dong等[23]为了探索Aly36B的催化机理，研究并了解了野生型Aly36B及其突变体的结构。基于结构和突变分析，解释了Aly36B对褐藻胶降解的催化机理。在催化过程中，Arg169，Tyr185和Tyr187负责中和底物的负电荷，而Lys143既充当催化碱又充当催化酸，代表了褐藻胶裂解酶的一种新型催化机制。定点突变这一高效改造，可以更清楚地了解催化机制的关键性氨基酸位点。

蛋白质的催化结构域是底物结合关键位点，结构域的改造是提高蛋白质活性的技术手段之一。Yan等[24]为了确定褐藻胶裂解酶中非催化结构域的功能，构建了仅包含催化结构域的重组AlgH-I和包含催化结构域和碳水化合物结合模块（CBM）结构域的AlgH-II。结果表明，缺失相关结构域，显著提高了重组酶的活性和热稳定性。与改造前的酶相比，修饰后的褐藻胶裂解酶酶活更高，可用于工业生产AOS。

4 褐藻胶裂解酶的应用

4.1 食品行业

褐藻胶裂解酶在食品行业的应用是降解褐藻胶产生褐藻胶寡糖，褐藻胶寡糖的抗菌活性用于食品保鲜。虞铭霞等[25]发现在6周冻藏过程中，海藻糖和褐藻胶寡糖显著（p＜0.05）降低了紫贻贝肉解冻损失率，肉组织结构相对较为完整、致密，细胞间隙冰晶颗粒面积较小，并维持了较好的弹性和咀嚼性等特性，同时有效抑制了紫贻贝肉中菌落总数的快速增加。因此海藻糖和褐藻胶寡糖可作为一种高效的低温保护剂，用于保持紫贻贝及其制品品质及延长冻藏产品货架期。陈淑琼等[26]研究结果显示，褐藻胶寡糖具有较强的清除自由基的能力和抑菌能力，将其作用于虾头中提取的多酚氧化酶，发现能有效地抑制多酚氧化酶的活性，表明褐藻胶寡糖对对虾的腐败菌生长具有一定的抑制作用，为酶解褐藻酸钠制备的褐藻寡糖的开发和对对虾的贮藏保鲜研究提供了理论依据。抗氧化性这一特性对食品保鲜，延长货架期提供了理论依据。

4.2 医药行业

褐藻胶裂解酶在医药领域的应用目前是抗生物膜剂的制备。铜绿假单胞菌是一种机会性致病病原体，临床上最常见的三大致病菌之一，是免疫受损个体和肺囊性纤维化患者主要致病因子。铜绿假单胞菌侵入肺上皮后，从非褐藻胶产生菌株（非黏液型）到褐藻胶产生菌株（黏液型）的遗传转化，有利于细菌生物膜的形成并粘附在肺黏膜并发生细菌的免疫逃逸，导致临床上出现持续性，难治性感染。王亚男[27]利用96孔板模型和flow cell模型检测，A1y08对铜绿假单胞菌生物膜具有抑制和清除作用。为了进一步改善褐藻胶裂解酶生物学特性和抗生物膜活性，以离子交联法将纯酶A1y08固定在壳聚糖（CS-NPs）上构建纳米粒。褐藻胶裂解酶A1y08具有较高活性及较好的温度稳定性和碱适应性以及高效降解褐藻胶底物的能力，同时固定化的褐藻胶裂解酶-壳聚糖纳米粒，将有助于褐藻胶裂解酶作为抗生物膜剂的进一步开发。这一应用对细菌性肺部感染提供了新的治疗方法。

5 结语与展望

综上所述，褐藻胶裂解酶具有极高的应用价值，能够适用于各个行业，长久以来受到国内外研究者的关注。随着基因工程技术的发展，基因工程技术将成为研究褐藻胶裂解酶的关键技术。因此，根据来源不同的褐藻胶，筛选出相应的产酶菌株，建立褐藻胶裂解酶的菌种库；应用研究褐藻胶裂解酶的活性机理，以便利用，可以更好地应用其特点造福人类；在对菌株产酶特异性研究的基础上，应用现代生物技术手段，对菌株的产酶种类、产酶效率进行分子层面的改造，提高其产酶活性和稳定性，以达到酶制剂工业化的需要，构建高效率的工程菌株；应用发酵工程、蛋白质工程、基因工程和酶工程技术，生产工具专用酶，酶解褐藻胶，开发具有特殊功能的褐藻寡糖，为海洋资源的高附加值化的开发，探索新的途径。以上几个方面将是褐藻胶裂解酶未来的研究方向。