油茶果壳原花青素的纯化及对α-淀粉酶活性抑制作用

刘承毅，吴雪辉,

1. 华南农业大学食品学院（广州 510642）；2. 广东省油茶工程技术研究中心（广州 510642）

油茶（Camellia oleifera），是我国重要的木本油料作物。目前，我国油茶种植面积已达到440万 hm2，并且有逐年增长的趋势[1]。油茶果壳是油茶果去仁后留下的外种皮，在制油过程中，1 t的油茶果实能产生大约0.54 t的果壳[2]，然而在实际中，果壳常常被当作废料处理或者冬天取暖用的燃料，利用率极低[3]。

原花青素（Proanthocyanidins），由一类黃烷醇单体聚合形成的多酚类物质[4]，是一种天然的强抗氧化剂[5]，同时还具有降血糖、抗肿瘤、抗衰老等作用[6-8]，应用前景广阔。近年来，研究发现油茶果壳中含有丰富的原花青素，含量在2%～5%左右[9-10]。目前对果壳中原花青素的研究主要集中在提取上，但获得的粗提物中含有较多杂质，需要进一步纯化。大孔树脂法因其具有易操作、选择性强等优点，常被应用于原花青素吸附纯化研究[11-12]。

通过抑制体内α-淀粉酶的活性，可以阻断淀粉等碳水化合物在体内转变糊精和寡糖的过程，减少碳水化合物的摄入，避免餐后血糖的快速升高，对控制血糖及治疗糖尿病有着重要意义[13]。研究表明，从植物中提取的原花青素可以通过抑制碳水化合物水解酶如α-淀粉酶的活性来预防高血糖[14]。

目前，关于油茶果壳中原花青素的纯化及其对α-淀粉酶活性抑制作用的研究均未见报道。因此，利用大孔树脂对油茶果壳中原花青素进行纯化，同时考察纯化后原花青素对α-淀粉酶活性的抑制作用，以期为油茶果壳的高值化利用和原花青素的研究开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油茶果（采自东莞樟木头林场）；大孔树脂S-8、HPD-600、AB-8、D-101、XDA-6、LSA-12、LX-213（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）；原花青素标准品（纯度≥95%，上海如吉生物科技发展有限公司）；阿卡波糖（上海伊卡生物技术有限公司）；猪胰α-淀粉酶（10 U/mg，美国Sigma-Aldrich公司）；其他试剂均为国产分析纯。

UV-5200型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；JJ1000型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；HWS24型电热恒温水浴锅（广州航信科学仪器有限公司）；LRH-150B恒温培养箱（广东泰宏君科学仪器股份有限公司）；HY-5回旋式振荡器（常州澳华仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 油茶果壳原花青素的提取

油茶果壳于45 ℃烘干，粉碎后过0.425 mm筛，备用。准确称取10.00 g样品，加入500 mL 43%（V/V，下同）乙醇溶液，于70 ℃提取13 min，抽滤，真空浓缩，得到原花青素粗提液。

1.2.2 原花青素标准曲线的制作及纯度的测定

原花青素质量浓度的测定参考孙芸等[15]的方法，以原花青素质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线y=2.63x+0.0394，R2=0.9991。

式中：C为测得的原花青素质量浓度，mg/mL；V为样液体积，mL；n为样品稀释倍数；m为原花青素纯化物干基质量，mg。

1.2.3 树脂的预处理

树脂于95%乙醇浸泡24 h，用蒸馏水洗至无醇味。依次用4倍体积的5% HCl溶液和4倍体积的5% NaOH溶液各浸泡4 h，用蒸馏水洗至中性，滤干，备用。

1.2.4 静态吸附和解吸实验

分别称取1.00 g不同型号的大孔树脂（S-8、HPD-600、LSA-12、XDA-6、AB-8、LX-213、D-101）置于锥形瓶中，加入40 mL质量浓度为1.24 mg/mL的原花青素粗提液，置于恒温摇床（25 ℃，120 r/min）中振荡24 h，测定吸附饱和后溶液中原花青素质量浓度。于上述饱和树脂加入40 mL 95%乙醇，振荡解吸24 h（25 ℃，120 r/min），测定解吸液中原花青素质量浓度。按式（2）～（4）计算吸附率、解吸率和回收率。

式中：C0、C1和C2分别为提取液原花青素质量浓度、吸附平衡原花青素质量浓度和解吸平衡原花青素质量浓度，mg/mL。

1.2.5 动态吸附与解吸试验

称取7.00 g树脂湿法装柱，固定上样质量浓度0.95 mg/mL，分别以0.25，0.50，0.75，1.00和1.25 mL/min的流速加入150 mL待上样液进行吸附，收集流出液并测定原花青素质量浓度，绘制不同流速下树脂的动态吸附曲线，计算吸附率和泄漏时间。在最佳上样流速条件下，分别考察乙醇洗脱体积分数（10%，30%，50%，70%和90%）、上样质量浓度（0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 mg/mL）和洗脱流速（0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 mL/min）对原花青素解吸效果的影响，收集流出液并测定原花青素质量浓度，绘制不同条件下树脂动态解吸曲线并计算回收率。真空干燥洗脱液，得原花青素纯化物，测定纯化物纯度。

1.2.6 油茶果壳原花青素对α-淀粉酶活性的抑制作用

1.2.6.1 原花青素对α-淀粉酶活性的抑制曲线

参考钟英英等[16]的方法，以阿卡波糖为阳性对照，测定不同质量浓度抑制剂对α-淀粉酶活性的抑制率。基于抑制剂质量浓度和抑制率回归方程计算IC50值（半抑制质量浓度）。

1.2.6.2 原花青素对α-淀粉酶抑制类型的研究

配制0.40，0.80，1.20，1.60和2.00 mg/mLα-淀粉酶溶液，抑制组原花青素质量浓度为0.30 mg/mL，非抑制剂组用缓冲液代替原花青素溶液，按照1.2.6.1的方法测定反应后溶液吸光度，以酶质量浓度对反应速率作图，判断原花青素对α-淀粉酶的抑制类型。

配制0.20%，0.60%，1.00%，1.40%和1.80%淀粉溶液，抑制组原花青素质量浓度为0.30 mg/mL，非抑制剂组用缓冲液代替原花青素溶液，按照1.2.6.1方法测定反应后溶液吸光度，作Lineweaver-Burk双倒数图，确定原花青素对α-淀粉酶可逆抑制类型。

1.3 数据处理

采用Excel 2019进行数据分析，Origin 2018软件进行作图及方程拟合。

2 结果与分析

2.1 静态吸附和解吸实验

图1为7种型号大孔树脂静态吸附和解吸试验结果。吸附率较高的树脂型号有S-8、XDA-6、AB-8，其中：S-8树脂吸附率最高，但解吸率和回收率很低；XDA-6树脂吸附率其次，且回收率最高；AB-8解吸率较高，但吸附率和回收率较差。综合考虑，选择XDA-6型号树脂作为纯化树脂。

图1 不同型号树脂对原花青素静态吸附与解吸结果

2.2 动态吸附与解吸试验

2.2.1 上样流速对树脂吸附原花青素的影响

图2为上样流速对树脂吸附原花青素的影响，泄露时间和回收率均随着上样流速的增大而减小。当流出液质量浓度达到上样液质量浓度的10%时，该质量浓度称为树脂吸附泄露点[17]。上样流速过快，会使目标产物与树脂接触不充分，容易造成树脂过载而泄露[18]；上样流速过慢，会造成上样时间过长。相比于0.25 mL/min，以0.5 mL/min流速上样时，泄露时间从520 min减小到180 min，而回收率仅减少4.11%，因此选择上样流速0.5 mL/min。

图2 上样流速对树脂吸附原花青素的影响

2.2.2 洗脱体积分数对树脂解吸原花青素的影响

图3为洗脱体积分数对树脂解吸原花青素的影响。10%乙醇洗脱时，原花青素的回收率和纯度均较低，表明10%乙醇对原花青素的选择性不强。原因是10%乙醇极性较大，而原花青素极性较低[19]，10%乙醇无法将原花青素从树脂中洗脱出来，洗脱物中多是极性较大的杂质。30%乙醇洗脱物，纯度较高，但会出现拖尾现象，50%～90%乙醇洗脱峰型较窄，成分集中，且回收率和纯度均较高，表明乙醇体积分数超过50%后，均能较好地洗脱出树脂中原花青素。综合成本考虑，选择50%乙醇作为洗脱剂。

图3 洗脱体积分数对树脂解吸原花青素的影响

2.2.3 上样质量浓度对树脂吸附原花青素的影响

图4为上样质量浓度对树脂吸附原花青素的影响。在不同上样质量浓度下，原花青素洗脱曲线变化相似，且随上样质量浓度的增大，峰尖浓度依次增大。上样质量浓度在0.5～1.5 mg/mL范围内时，回收率缓慢下降，超过1.5 mg/mL后急速下降，原因是原花青素浓度增大，树脂表面基团逐渐饱和，传质速度变慢[20]，上样质量浓度超过1.5 mg/mL后，部分原花青素未被吸附就流出，回收率快速降低。原花青素纯度先上升后降低，在上样质量浓度为1.5 mg/mL时达到最大，与郑洪亮[21]研究中红皮云杉球果原花青素纯度随上样质量浓度的变化趋势相同。最终选择上样质量浓度1.5 mg/mL。

图4 上样质量浓度对树脂吸附原花青素的影响

2.2.4 洗脱流速对树脂解吸原花青素的影响

图5为洗脱流速对树脂解吸原花青素的影响。随着洗脱流速的增大，峰尖浓度减小；纯度随洗脱流速的增大，持续减小，在流速超过1.00 mL/min后快速下降；回收率先增大后减小，并在1.5 mL/min时达到最大值。流速从1.00 mL/min到1.50 mL/min，纯度相对下降较多，而回收率增加不多。综合考虑，最佳洗脱流速选择1.0 mL/min，在此条件下，原花青素纯度达到53.41%，相比于粗提物纯度14.82%，纯化物纯度提高了3.6倍。

图5 洗脱流速对树脂解吸原花青素的影响

2.3 油茶果壳原花青素抑制α-淀粉酶活性试验

2.3.1 原花青素对α-淀粉酶活性的抑制曲线

图6为油茶果壳原花青素对α-淀粉酶活性的抑制曲线。原花青素质量浓度为0.08～0.40 mg/mL时，抑制率迅速上升；0.40～1.00 mg/mL范围内，抑制率上升速度变缓；质量浓度超过1.00 mg/mL后，抑制率趋于稳定，并在2.00 mg/mL达到最大值95.36%，高于对照物阿卡波糖（90.93%）。通过对图中抑制剂浓度和抑制率的关系进行拟合，计算得到原花青素IC50值为0.24 mg/mL，低于对照物阿卡波糖IC50值（0.27 mg/mL）。图6显示，油茶果壳原花青素对α-淀粉酶活性的抑制效果与质量浓度呈现正量效关系。最大抑制率和IC50值均表明油茶果壳原花青素比阿卡波糖有更好的抑制效果。

图6 原花青素对α-淀粉酶活性的抑制曲线

2.3.2 原花青素对α-淀粉酶抑制类型的研究

图7为原花青素对α-淀粉酶活性的抑制动力学曲线。在酶质量浓度与反应速率相互关系中可以发现，抑制剂组的直线斜率低于非抑制组，并且抑制组和非抑制组直线均经过原点。根据酶反应动力学曲线特征[22]，油茶果壳原花青素对α-淀粉酶活性的抑制作用为可逆性抑制。

图7 原花青素对α-淀粉酶的抑制动力学曲线

图8为原花青素对α-淀粉酶抑制作用的双倒数图。结果发现，抑制剂组和非抑制剂组两条直线相较于Y轴，在有抑制剂存在时，Km值增大，Vmax值不变，表明原花青素对α-淀粉酶的可逆抑制类型属于竞争性抑制。此时，酶抑制剂和底物在结构上有相似之处，酶抑制剂与酶的结合阻断了底物与酶的结合，降低了酶和底物的亲和能力，酶反应的速率减慢[23]，与刘睿等[22]研究的高粱原花青素对α-淀粉酶的抑制类型一致。

图8 原花青素对α-淀粉酶抑制作用的双倒数图（Lineweaver-Burk）

3 结论

探究了油茶果壳中原花青素的纯化工艺条件，并考察纯化后的原花青素对α-淀粉酶活性的抑制作用。采用XDA-6大孔树脂树脂，在上样流速0.50 mL/min、洗脱乙醇体积分数50%、上样质量浓度1.50 mg/mL、洗脱流速1.00 mL/min条件下进行纯化，原花青素纯度达到53.41%，纯度相比于粗提物（14.82%）提高了3.6倍。油茶果壳原花青素对α-淀粉酶活性的抑制率可达到95.36%，IC50值为0.24 mg/mL，原花青素通过可逆的竞争性作用实现对α-淀粉酶活性的抑制。研究纯化的原花青素能够有效抑制α-淀粉酶的活性，抑制效果超过阿卡波糖，有望作为膳食补充剂应用于血糖控制及糖尿病的防治。