尾静脉注射miR-10a过表达慢病毒后动脉粥样硬化小鼠头臂干动脉内皮损伤情况、硬化斑块面积观察

崔佳，李菲，张明明，马倩，路永刚，帖彦清

1 河北省人民医院检验科，石家庄050051；2 河北医科大学第一医院保健处

动脉粥样硬化是心脑血管发病的病理学基础，是由多种免疫细胞及其产生的抗体［1］、血小板异常激活［2］、内皮细胞损伤［3］、炎性细胞因子［4］等共同参与的慢性炎症性疾病。在各种病理因素如炎症、创伤及自身免疫性疾病等的刺激下，可引起内皮细胞损伤、血小板异常激活，使内皮细胞及血小板表面的磷脂类物质充分暴露，此时存在于血液中的β2糖蛋白I（β2GPI）与其表面的抗磷脂抗体（APL）相结合形成复合物［5］，进而引起PI3K/AKT/mTOR 信号通路的激活［6-7］，引起血管内皮细胞增殖、内膜增生及血管的病变，最终引起动脉粥样硬化的形成［8］。微小RNA（miRNA）是一类有19～24 个核苷酸的小分子RNA，miRNA-10a 作为miRNA 中的重要类型，参与炎症、免疫应答反应等多种生物学过程［9］。目前，已经证实miR-10a与多个癌种如结直肠癌［10］、弥漫大B细胞淋巴瘤［11］等存在着密切的关系。既往研究［12］表明，动脉粥样硬化组织的内皮细胞中miR-10a 通过下调炎症分子进而抑制动脉粥样硬化的形成或进展。2019年12月—2020年9月，本研究观察了尾静脉注射miR-10a 过表达慢病毒后动脉粥样硬化小鼠头臂干动脉内皮损伤情况、硬化斑块面积变化，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 动物、过表达miR-10a慢病毒及试剂 10只雄性apoE-/-小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，过表达miR-10a 慢病毒购自北京合生基因科技有限公司。磷酸化-PI3K、磷酸化-AKT 及磷酸化mTOR 均购自CST 公司，冷冻高速离心机购自赛默飞世尔科技有限公司，正置显微镜购自Carl Zeiss公司，石蜡切片机购自Leica 公司，体视解剖显微镜购自Leica 公司，Western 用电泳仪、电转移槽及电源均购自北京六一生物科技有限公司，全自动凝胶成像系统购自Syngene 公司，全自动荧光PCR 分析仪购自罗氏公司。

1.2 动物分组、动脉粥样硬化模型制作及过表达miR-10a 慢病毒给予方法 6 周雄性apoE-/-小鼠共10 只，体质量（21 ± 2）g，饲养于河北省人民医院SPF 级环境中，室温保持在（21.0 ± 0.2）℃，用含1.25%高胆固醇饲料喂食4 周，建立小鼠动脉粥样硬化模型。将成功建立动脉粥样硬化模型的小鼠随机分为模型组和miR-10a 组，每组5 只。miR-10a 组小鼠尾静脉注射100 µL 1×108PFU/mL 的miR-10a慢病毒，模型组小鼠尾静脉注射等量生理盐水。两组小鼠继续饲养3 周后处死，取头臂干动脉粥样硬化血管组织用于实验。

1.3 两组小鼠头臂干动脉内皮损伤情况观察 取头臂干动脉粥样硬化血管组织，使用2.5%的戊二醛混合固定液固定、脱水、渗透、包埋后，半薄切片，用甲苯氨蓝染色观察，光镜定位选取所需要的部位，超薄切片（500 A），醋酸钠、硝酸铅双重染色，透射电镜下观察小鼠内皮损伤情况。

1.4 两组小鼠头臂干动脉中动脉粥样硬化斑块面积测算 采用改良Masson 三色染色法。取头臂干动脉粥样硬化血管组织，使用2.5%的戊二醛混合固定液固定、脱水、渗透、包埋后，半薄切片，固定于Bouin液媒染，冲洗干净，天青石蓝滴染，Mayer苏木素染3 min，酸性乙醇分化，然后用丽春红品红滴染，用磷钼酸溶液处理，苯胺蓝染色5 min后弱酸处理2 min，乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，于普通光镜下观察染色情况，并测算动脉粥样硬化斑块面积。

1.5 两组小鼠头臂干动脉动脉粥样硬化斑块内miR-10a检测 采用Q-PCR法。使用TRIzol试剂提取头臂干动脉粥样硬化血管组织的总RNA，按照miR⁃cute miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cD⁃NA，在冰上配置PCR 反应体系后放入PCR 仪进行PCR 反应。引物序列为：miR-10a 上游引物为5′-ACATCATACCCTGTAGAACCGAA-3′，下游引物为5′-GATTGGATGTTCTCCACAGTCTC-3′；内参GAP⁃DH上游引物为5′-GTGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3′，下游引物为5′-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3′。以2-∆∆Ct法表示小鼠头臂干动脉动脉粥样硬化斑块内miR-10a的相对表达量。

1.6 两组小鼠头臂干动脉动脉粥样硬化斑块内p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白检测 采用Western blotting 法。将剥离的头臂干动脉粥样硬化血管组织放入灭菌的研磨器中，加入细胞裂解缓冲液RI⁃PA，放于冰上30 min，4 ℃条件下14 000 r/min 离心10 min，收集上清液即为可溶性蛋白，应用BCA 法检测可溶性蛋白的浓度，然后制备SDS-PAGE 胶，将制备好的SDS-PAGE 胶放入电泳槽内进行电泳，SDSPAGE 电泳分离蛋白后再转膜至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉封闭，并于4 ℃冰箱中一抗孵育过夜，TBST充分洗涤后加入相应二抗，室温孵育2 h，ECL 显色后于化学发光凝胶成像系统中显影，以GAPDH 为内参，IPP 6.0软件进行灰度扫描分析，以GAPDH 条带的光密度值矫正，计算目的蛋白的相对表达量。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值×100%。

1.7 两组小鼠血清中抗磷脂抗体（anti-β2GP1）滴度检测 采用Elisa 法。将小鼠处死前先进行眼球取血，4 ℃条件下12 000 r/min 离心10 min，取其上清液即为血清，按1︰1 000 的比例进行稀释，将质控品和稀释样本加入微孔反应板条中，室温温育30 min，洗涤3次，加入酶结合物室温孵育15 min，再次洗涤，加入TMB 底物溶液室温孵育15 min，加入终止液室温孵育5 min，板式酶标仪检测血清中antiβ2GP1滴度。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计量资料以±s表示，比较用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠头臂干动脉内皮损伤情况比较 模型组在电镜下可见内皮细胞受损、剥离、内膜增生、血管病变、表面粗糙；miR-10a 组内皮细胞完整性较好，细胞长轴与血流方向平行，细胞排列相对整齐且内膜表面相对平滑，见图1。

图1 电镜下观察两组小鼠头臂干动脉中内皮细胞的变化情况（箭头处为损伤的内皮细胞）

2.2 两组小鼠头臂干动脉中动脉粥样硬化斑块面积比较 模型组小鼠头臂干动脉中动脉粥样硬化斑块面积为（11 560.0 ± 731.0）µm2，miR-10a 组小鼠头臂干动脉中动脉粥样硬化斑块面积为（8 779.0±461.4）µm2，两组相比，P<0.05。

2.3 两组小鼠头臂干动脉动脉粥样硬化斑块内miR-10a 相对表达量比较 模型组小鼠头臂干动脉动脉粥样硬化斑块内miR-10a 相对表达量为0.25 ± 0.06，miR-10a 组小鼠头臂干动脉动脉粥样硬化斑块内miR-10a 相对表达量为0.37 ± 0.05，两组相比，P<0.05。

2.4 两组小鼠头臂干动脉动脉粥样硬化斑块内p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白相对表达量比较 模型组小鼠头臂干动脉动脉粥样硬化斑块内p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白相对表达量分别为1.245 ±0.124、1.058 ± 0.048、0.862 ± 0.083，miR-10a 组小鼠头臂干动脉动脉粥样硬化斑块内p-PI3K、p-AKT及p-mTOR 蛋白相对表达量分别为0.833 ± 0.046、0.533 ± 0.047、0.293 ± 0.050，两 组 相 比，P均<0.05。

2.5 两组小鼠血清中anti-β2GP1 滴度水平比较模型组小鼠血清中anti-β2GP1 滴度水平为（0.40 ±0.08）U/L，miR-10a 组小鼠血清中anti-β2GP1 滴度水平为（0.26±0.06）U/L，两组相比，P<0.05。

3 讨论

动脉粥样硬化是一种以内皮功能障碍、内皮脂质沉积、平滑肌细胞增殖、血小板异常激活、细胞凋亡和坏死、局部和全身炎症为特征的慢性炎症性疾病，主要涉及先天性免疫及适应性免疫，严重危害着中老年人的身体健康。其中，单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞在调节动脉粥样硬化促炎症反应和动脉粥样硬化抗炎症反应之间的平衡发挥着重要的作用，一旦这种平衡在一些病理因素（如炎症、内皮细胞损伤、血小板的异常活化及自身免疫性疾病）作用下遭到破坏，即可引起动脉粥样硬化的形成［13-14］。MicroRNA 是一类约有19～24 个核苷酸的内源性、非编码的单链小分子RNA［9］，它们通过与靶RNA 结合，在转录后抑制靶基因的表达或翻译，从而影响细胞的增殖、凋亡或细胞周期，miR-10a 是其家族中的一员。既往研究表明［15］，主动脉弓和主动脉肾分支的动脉粥样硬化易感区域的内皮miR-10a低于其它部位，说明miR-10a 对动脉粥样硬化的调节具有抑制作用，但miR-10a 对动脉粥样硬化影响的机制尚未完全清楚。为此，本研究以动脉粥样硬化小鼠为研究对象，根据尾静脉是否注射miR-10a过表达慢病毒，将实验分为模型组和miR-10a 组，进而探讨miR-10a对小鼠动脉粥样硬化的机制。

APL 主要包括抗心磷脂抗体（ACL）、β2GPI 抗体及狼疮抗凝物（LA）等［16］。当机体的免疫功能亢进时，可引发自身免疫性疾病，从而释放大量的APL。当机体受到炎症、内皮细胞损伤及血小板异常等病理因素作用时，内皮细胞及血小板表面的磷脂类物质充分暴露，血液中的β2GPI 即可与其结合形成复合物，此时APL 则与此复合物发生抗原-抗体反应，进而引起下游PI3K/AKT/mTOR 信号通路的激活。PI3K/AKT/mTOR 信号通路广泛存在于细胞中，并参与细胞的生长、发育、调控机制［17］。PI3K 是一种蛋白激酶，当其发生磷酸化后，即可产生磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）第二信使，PIP3 与细胞内AKT 表面的PH 特殊结构域以及磷脂酰肌醇依赖性激酶-1（PDK1）结合，从而直接导致AKT 发生磷酸化［18-19］。AKT 具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，在蛋白质的合成、细胞代谢、细胞增殖及血管生成等方面占据着重要的地位。mTOR 是磷脂酰亚胺-3激酶家族的一种，包括两个功能多样的蛋白复合物：mTOR 复 合 物1（mTORC1）和mTOR 复 合 物2（mTORC2）［20-21］。mTORC1 信号级联反应由p-AKT激活，同时，mTORC2 也可磷酸化AKT。mTOR 是哺乳动物自噬信号通路的主要靶点，通过调控细胞转录、翻译和细胞骨架组织，促进了蛋白质的合成、细胞周期和血管生成［22］。当上述信号通路激活后，可引起血管内皮细胞增殖和内膜增生而造成血管病变，最终引起动脉粥样硬化发生。基于上述研究，本研究发现，miR-10a 组anti-β2GP1 滴度水平明显下降，且p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白相对表达量明显降低，差异均有统计学意义，这与上述研究一致。基于上述研究及本研究结果显示，当miR-10a表达量增加时，其可抑制APL 介导的PI3K/AKT/mTOR 信号通路的激活而下调PI3K、AKT、mTOR 蛋白的表达，进而抑制动脉粥样硬化的形成，减少内皮细胞的损伤。

综上所述，尾静脉注射miR-10a 过表达慢病毒可改善动脉粥样硬化小鼠头臂干动脉内皮损伤情况、缩小硬化斑块面积，其机制与过表达miR-10a 抑制抗磷脂抗体介导的PI3K/AKT/mTOR 信号通路激活有关。