盐碱土耐盐菌株保存方法的研究

2021-08-24张燕妮杨雨涵李双全鞠会艳

人参研究 2021年4期

张燕妮，杨雨涵，辛阳，李双全，鞠会艳*

（吉林大学植物科学学院·吉林长春·130062）

在微生物相关研究工作中，菌种的保存是十分重要的。每株菌种性质不一样，在利用土壤微生物进行相关研究时，能从土壤中分离出一些有意义的菌种，但接种到平板上的菌株在4℃低温条件下也仅能保存数天，并且多次接种后菌株性质也会发生一些变化，故应当对菌株进行长期保存以便今后更有效地分析菌株的生理生化性质和实践应用意义。本研究探索了几种菌种的保存方法，并比较了这几种方法的优劣[1-3]。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 土壤样品

2020年从白城市通榆县新华镇永安屯A、B、C和D不同地点采取一定土壤样品。这几个地点位于东经123°1′、北纬44°47′、海拔153.0m、气压995.0hPa。这8个地点的土壤属于pH 8.60的盐碱土。

1.1.2 菌株来源

从采取的盐碱土中分离纯化得到9种菌株。其中4种真菌中Y8和C4-3通过了12%氯化钠的盐筛，Y10、Y11通过了16%氯化钠的盐筛；2种细菌D4-1、X10和3种放线菌X12、ⅠB、Ⅲ18均通过了12%氯化钠的盐筛。

1.1.3 主要培养基和仪器

LB培养基、PDA培养基[2]、6mm正方形滤纸片、冻存管、10%甘油、30%甘油生理盐水（15mL甘油+氯化钠0.45g+蒸馏水至50mL）、1.5mL EP管、移液器、恒温培养箱、4℃冰箱、-20℃冷冻柜、-80℃冷冻冰箱。

1.2 保存方法

1.2.1 PDA生长菌株保存[4,5]

A：滤纸片保存法（-20℃保存）：将所收集的菌种分别接种培养基，用无菌小镊子夹住灭菌滤纸片（9片滤纸片）放入平板中接种的菌周围（详见图1），等待菌丝长至滤纸片上后，可用无菌小镊子将其小心放入冻存管中。每个冻存管放3片，为3个重复，旋紧盖子后做好标注放入-20℃冰箱冷冻保存。

图1 放入滤纸片之后等待长满菌丝的5个平板Fig.1.Five plates waiting to be covered with hyphae after inserting the filter paper

B：冷冻管保存法（-80℃保存）：将所收集的菌种分别接种培养基，25℃培养3~5天后,向1.5 mL EP管中加入1.2mL灭菌过的10%甘油，用接种环从菌株生长良好的PDA平板上刮取适量菌丝转移到EP管中，每个菌种保存3份，做好标注后置于-80℃低温冰箱中保存。

1.2.2 LB生长菌株保存[6]

A：斜面保藏法(4℃保存)：将灭好菌的LB固体培养基趁热吸取800μL装进1.5mL EP管等待凝固，将分离得到的菌株接种到LB斜面上，在25℃培养3~5天，直到菌株长满斜面，然后向试管中加入经灭菌的10%甘油350μL，做3个重复，置于4℃冰箱保存。

B：菌液保存法（-20℃保存）：将所收集的菌种分别接种培养基，25℃培养3~5天后。吸取2mL高压灭菌的30%甘油生理盐水（15mL甘油+氯化钠0.45g+蒸馏水至50mL）洗下平板里的菌苔,吸取1.2 mL菌液加入高压灭菌的洁净1.5mL EP管中,最后放入-20℃冷冻柜中保存。

2021年1 月初至3月中旬，保存时间两个多月。

1.3 活化

1.3.1 滤纸片保存菌种的活化-20℃保存的真菌用镊子取出滤纸片置于PDA培养基上，倒置放入21℃恒温培养箱中培养。

1.3.2 冷冻管保存菌种的活化

-80℃保存的真菌放置16h再进行活化。另外一种方法是将-80℃保存的真菌直接吸取200μL再进行涂板（PDA培养基），倒置放入21℃恒温培养箱中培养。

1.3.3 斜面保存菌种的活化

4℃细菌、放线菌用接种环挑出小块放进LB培养基上，正置放入21℃恒温培养箱中培养。

1.3.4 菌液保存菌种的活化

-20℃细菌、放线菌直接吸取200μL再进行涂板（LB培养基），倒置放入25℃恒温培养箱中培养。

2 结果与分析

2.1 不同保存方法菌株的活化分析

2.1.1 PDA上生长的菌株

由图2可见菌株活化后的生长情况，菌株活化涂板后生长基本遍布整个培养皿。滤纸片保存的菌株生长良好，应用滤纸片保存的真菌全部生长，活化结果较好。但是应用冷冻管保存的真菌中C4-3完全没生长（图2下排左边第2个培养皿）。图3可见滤纸片保存的C4-3菌株活化后在培养基上生长了（最右边的培养皿），但冷冻管保存的C4-3菌株活化后没有生长。