白城产防风中3种活性成分含量测定

2021-08-24岳显文鲍慧玮朱跃亚

人参研究 2021年4期

岳显文，鲍慧玮，朱跃亚，曹原，徐阳*

（1.白城医学高等专科学校药学院，白城137000；2.长春中医药大学药学院，长春130117；3.吉林省蓝浦浩业科技有限公司，长春130000）

防风Sapos hnikovia divaricate（Turcz.）Schischk.为伞形科植物防风的干燥根[1]，别名旁风、东防风[2]。防风在我国应用历史悠久，始载于《神农本草经》列为上品，主治外感风寒、头痛目眩、周身疼痛、骨节疼痛、风寒湿痹等证[3]；明代李时珍在《本草纲目》中称，“防风，可治男子一切劳伤，补中益神”。

防风是传统的辛温解表药[4]，防风中化学成分较多，其中色原酮类化合物是活性较明确的物质，包括升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷等，除此之外还有多糖类、挥发油类、香豆素类等物质[5-6]。有研究指出，防风中的色原酮类物质具有抗氧化、解热镇痛、抗炎等作用[7-8]。因此，本文建立一种同时测定防风中升麻素、升麻苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量的HPLC方法，并对白城产方法中3种活性成分含量的进行测定，可作为防风质量标准研究的参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

华谱S3000高效液相色谱仪、DAD检测器（华谱科仪（北京）科技有限公司）；DFY-500型多功能高速中药粉碎机（温州顶历医疗器械有限公司）；KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AB135-S型电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司）。

1.2 试药

防风采集于白城和内蒙古地区，由白城医学高等专科学校中药学岳显文副教授鉴定为百合科虎眼万年青属多年生草本植物虎眼万年青Ornithogalum caudatum Jacq.。

升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（批号：111710-200602，111522-201913，111523-201811，含量为91.7%，94.6%，97.4%，购于中国食品药品检定研究院）。甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈股份有限公司）；磷酸（分析纯，北京化工厂）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液配制

分别取升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为1.164、2.501和1.817mg/mL的对照品溶液。分别精密移取上述3种溶液各0.4、1.0和1.0mL，置同一10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷浓度分别为46.56、250.1、181.7μg/mL的混合对照品储备液。精密移取混合对照品储备液1mL，用甲醇稀释10倍，得到混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液配制

取本品细粉约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

AlltimaTMC18色谱柱（5μm，4.6mm×250mm）；以甲醇（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱程序为0~5min，40%A；5~20min，40%→50%A；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量为20μL；检测波长为254nm。由图1结果表明，待测成分色谱峰均达到基本分离，理论塔板数均大于2000。

图1 防风混合对照品（A）和供试品（B）的HPLC图谱

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系试验

分别精密吸取混合对照品储备液0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得到6个不同浓度梯度的混合对照品溶液。依法进行分析，以对照品浓度（c，μg/mL）为横坐标X，色谱峰面积（A）为纵坐标Y，进行线性回归。计算得出升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的线性回归方程分别为Y=17.152X-1.691（r=0.9996）、Y=10.064X-12.773（r=0.9999）、Y=8.4517X+24.681（r=0.9995），表明升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷浓度分别在0.9312~46.56μg/mL、5.002~250.1μg/mL、3.634~181.7μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验

取配置好的防风供试品溶液，连续进针6次，测得升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD值分别为1.03%、0.45%和0.78%，表明该仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

取配置好的防风供试品溶液，放置室温，分别于0、2、4、8、12、24h注入高效液相色谱仪中检测，测得升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD值分别为0.96%、0.25%和0.21%，表明防风供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验

取防风样品（批号：20200601）6份，粉碎，每份取细粉约0.25g，按照“2.1.2供试品溶液配制”项下方法制备供试品溶液，依法进行检测，测得升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均含量分别为0.020%、0.134%和0.114%，RSD值分别为1.33%、1.56%和1.28%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验

取已经测得含有量的防风样品6份，粉碎，每份称取约0.125g，精确称量，再加入升麻素对照品溶液（25.05μg/mL）0.05mL、升麻素苷对照品溶液（167.3μg/mL）0.1mL和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液（142.0μg/mL）0.1mL，置同一带塞锥形瓶中，按照“2.1.2供试品溶液配制”项下方法制备供试品溶液，依法进行检测。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.4 防风样品中3种活性成分的含量测定

取白城产地防风样品，按照“2.1.2供试品溶液配制”项下方法制备供试品溶液，在“2.2色谱条件”下进样分析，计算防风样品中升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷3种活性成分含量。结果见表2。

表2 白城和内蒙古防风三种成分含量测定结果（%）

3 讨论与结论

3.1 测定波长的选择

本实验采用的DAD检测器，参考《中华人民共和国药典》2020年版和相关文献报道[9-11]，同时考察了防风供试品溶液在210、238、254、322nm等多个检测波长下的升麻素、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷3种待测成分的吸收情况，最终选择检测波长为254nm时，待测成分色谱峰吸收最好，且基线平稳。

3.2 流动相的选择

参照《中华人民共和国药典》2020年版一部“防风”含量测定项下的方法[1、12]，以甲醇∶水（40∶60）为流动相，三者保留时间均适中，但是测定样品时发现色谱图中3种待测成分色谱峰分离度不够，所以改用梯度洗脱（0~5min，40%A；5~20min，40%→50%A），待测成分色谱峰与其他成分色谱峰分离度较好，且峰形较对称。