自然流产绒毛低深度全基因组测序的遗传学病因分析

崔凤姬，张志强，张明杰，焦泽华，蒙景艳

(1.内蒙古计划生育科学技术研究所，内蒙古 赤峰 024000；2.赤峰市中心血站，内蒙古 赤峰 024000)

0 引言

自然流产发病率为15%～40%，其中80%为早期自然流产[1]。文献报道，胚胎染色体数目异常是早期自然流产最常见的原因，占40%～60%。随着分子遗传学技术的不断发展，对染色体异常检出率逐步提高，我们发现染色体结构异常也是自然流产的重要原因。

目前临床上常用的绒毛组织细胞培养法染色体核型分析是一种传统的方法，存在很多缺点，如组织污染会造成培养失败，染色体微缺失微重复症不能检测等[2]。近年来，随着低深度全基因组测序的不断发展，因其具有高通量、高准确率、高分辨率、高效等特点而广泛应用于临床疾病的诊断。我们通过使用低深度全基因组测序技术检测染色体数目和结构异常，了解胚胎停育285例患者绒毛染色体异常情况及其与患者年龄的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集我院2018年11月至2020年11月妇产科门诊经超声提示“胚胎停育”并自愿人工流产患者285例的临床资料。年龄22～47岁，平均（32.78±5.24）岁，胚胎停育的孕周为6～12周，平均（8.71±2.04）周，排除孕期感染以及不良接触史，均获得受检者知情同意。本研究征得赤峰市妇产医院伦理委员会批准。

1.2 低深度全基因组测序技术

取约30mg绒毛，用生理盐水清洗干净，消化裂解绒毛组织，纯化并洗脱后得到DNA,用Qubit来测DNA浓度，提取出的基因组DNA酶切断，文库构建，PCR扩增，得到DNA小片段文库。乳液PCR和模板富集后使用DA8600平台进行测序，检测染色体非整倍体和全基因组范围的拷贝数变异，判断绒毛流产组织的染色体情况。将高通量测序所得数据通过公共数据库进行分析。

1.3 统计学分析

Sigma Plot 2000软件进行数据分析，数值均用均数±标准差（）表示，采用t检验进行显著性分析。

2 结果

2.1 胚胎停育绒毛染色体数目异常情况

285例胚胎停育绒毛中，染色体正常135例（47.4%），染色体异常150例（52.6%），其中染色体数目异常132例（46.3%）。132例染色体数目异常的患者中常染色体三体102例（73.5%），包括16号染色体25例、22号染色体14例、15号染色体12例、2号染色体6例、21号染色体6例、8号染色体6例、18号染色体5例、10号染色体5例、9号染色体4例、14号染色体4例、6号染色体3例、4号染色体2例、3号染色体1例、5号染色体1例、17号染色体1例、20号染色体1例、13号染色体1例、7+21号染色体1例、2+13号染色体1例、16+21号染色体1例、8+14号染色体1例、9+8号染色体1例；单体9例（6.8%），包括X-单体8例、21-单体1例；嵌合体21例（15.9%），包括4-三体（74%）、2-三体（72%）、16/22-三体（67%）、22-三体（67%）、16-三体（66%）、-X/+22（59%）、4-三体（52%）、15-单体（47%）、4/6-三体（47%）、22-三体（42%）、15-三体（33%）、-X/+Y,XYY（31%）、-X/+21（30%）、+7/-7（30%）、13/18-三体（30%）、7-三体（28%）、10/18三体（21%）、6-三体（21%）、6-三体（21%）、+15/-X（10%）、-X（9%）各1例。

2.2 胚胎停育绒毛染色体结构异常情况

在染色体结构异常的18例中，有7例（38.9%）染色体缺失，10例（55.6%）染色体重复，染色体缺失重复同时存在的1例（5.6%）。染色体结构异常18例中检出拷贝数变异23种，查询公共数据库11例被判定为致病性CNVs,2例可能致病性CNVs，5例致病性未知，见表1。

表1 胚胎停育绒毛染色体结构异常CNVs统计结果

2.3 年龄与染色体异常的关系

低龄孕妇196例患者中染色体异常96例，异常率为49%；高龄孕妇89例患者中染色体异常59例，异常率为60.7%。两组患者染色体异常率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

高龄孕妇染色体数目异常50例（56.2%）高于低龄孕妇染色体数目异常82例（41.8%）。低龄孕妇染色体结构异常14例(7.1%)高于高龄孕妇染色体结构异常4例(4.9%），差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 低龄孕妇与高龄孕妇染色体分布情况

3 讨论

妊娠早期的自然流产现已上升为临床妇产科工作中遇到的最常见的疾病之一，患病率呈逐年上升趋势且病因复杂。胚胎染色体异常是导致自然流产的一个主要因素[3]，并且也是出生缺陷的主要危险因素。早期流产绒毛染色体检测，为患者提供有效的生育相关的遗传咨询，也激励人们去寻找染色体正常胎儿流产的病理学原因[4]。

低深度全基因组测序检测在本285例绒毛检测中成功率为100%，染色体异常占52.6%（150/285），研究提示染色体异常是早期胚胎停育的主要原因，文献报道的50%～60%相符合[5]。低深度全基因组测序应用检测范围广，已知的100kb以上的微缺失微重复和＞10%嵌合能检测，所以比绒毛培养和FISH法的染色体异常率高。以往的核型分析只能检查出10M以上的染色体结构异常，这就导致许多存在微小结构异常的常常被漏诊。本研究150例胚胎停育绒毛染色体异常中，染色体数目异常132例（46.3%）其中，常染色体三体102例，占比73.5%（102/132）；单体9例，占比6.8%（9/132）；异常染色体除了1号、11号、12号以及19号染色体以外均有检出，其中16号染色体25例、22号染色体14例、15号染色体12例，以上三种最多见，和以往文献报道数据[6]相符合，本研究还检测到染色体嵌合体21例，占比15.9%（21/132），嵌合体是染色体异常类型之一，指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体，是由于细胞有丝分裂不分离或染色体丢失所导致的。近些年，陆续出现的基于测序技术的基因拷贝数变异分析平台开始在染色体异常检测方面应用，在某些方面，如嵌合体检测，甚至比芯片平台更具优势[7-8]。

本研究还检出染色体结构异常有18例，占比6.3%，Zhu等在SNP-Array平台研究证明绒毛异常染色体中，微缺失和微重复占7.14%[9]，与文献报道一致，18例染色体结构异常中检出拷贝数变异CNVs23种，其中11例为致病性CNVs包含了4p缺失综合征2例，临床表现为生长发育迟缓，智力障碍，癫痫，发病率1/50000。2q33微缺失综合征（Glass综合征）1例，临床表现为中度至重度发育迟缓，言语迟缓，骨骼异常。2p部分三体综合征1例，临床表现为严重智力障碍等。文献报道，采用低深度全基因组测序对智力低下的患者进行遗传学分析，结果显示这些患者染色体结构上存在微缺失微重复[10]。本研究2例疑似病例，需对其父母进行检测，看是否遗传自双亲，包含5例致病性未知的CNVs，还有待于进一步研究。核型分析检测10M大小的结构异常，用FISH准确检测3Mb大小的结构异常，用低深度全基因组测序准确检测已知的100kb以上的结构异常，因此该技术检出率高于别的方法，避免因微小片段引起的微缺失微重复异常漏诊，为临床查明流产原因提供依据，为患者下次妊娠提供帮助。

染色体数目异常与女性年龄的增长呈正相关，随着女性年龄的增长，染色体三体比率增加，流产率增加[11-12]，因此，我们对胚胎停育的患者年龄进一步做了分析。本研究发现，高龄孕妇（≥35岁）绒毛组织染色体异常率占60.7%（59/89），高于低龄孕妇（＜35岁）染色体异常率占49%（96/196），差异有统计学意义（P＜0.05），这个结论跟文献报道一致。本研究低龄孕妇结构异常率占7.1%（14/196）高于高龄孕妇结构异常率4.9%（4/89），差异无统计学意义（P＞0.05）。染色体结构异常不分年龄，本研究反而低龄孕妇高于高龄孕妇,主要症状为发育迟缓和智力低下等，染色体异常孕妇再次妊娠需进行产前诊断阻断出生缺陷儿的发生。

综上所述，染色体异常是早期胚胎停育的主要病因。低深度全基因组测序作为全新的技术，能快速、准确的检测出染色体数目异常及核型技术无法检测的拷贝数变异，极大的提高了诊断水平。同时，低深度全基因组测序可以检测出胚胎停育的绒毛组织染色体微缺失和微重复，使检测染色体结构异常方面有了新的途径，并且检测率和分辨率高，明确早期流产遗传学病因，值得临床广泛应用，为患者后续的再生育和优生提供诊断指导。