加味济生肾气汤对糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化的影响*

黄天慧 江 波 孙勤国 徐鸿婕 丁晓明 阳国英

武汉大学同仁医院(武汉市第三医院)中医科，武汉 430060

近年来随着生活质量提高，糖尿病发病率逐年增加，全球成人糖尿病患病人数预计将在2030年上升到4.39亿[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)作为糖尿病并发症之一，是最终导致糖尿病患者死亡的重要因素[2]。因此，加强对糖尿病及其并发症DN的研究显得尤为必要。从目前临床和实验研究来看，中药不仅有降血糖、控制DN的作用，而且具有疗效温和、持久、恢复性好及针对性强等优点[3-4]。本课题组自拟加味济生肾气汤，以济生肾气汤温阳化气行水，加以桃仁活血祛瘀、黄芪补气利尿、大黄活血逐瘀通经，以起到温肾阳、散瘀结、行气利水的作用。基于此，本研究采用不同剂量的加味济生肾气汤对高糖高脂饲料联合链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的DN大鼠进行治疗，旨在探究其对DN大鼠肾脏纤维化的影响及作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物、药物与试剂

于湖北省疾病预防控制中心购置66只SPF级雌性SD大鼠，体重为(226.7±17.5)g，月龄3个月(合格号：NO.42000600026493)。

中药材购自武汉市第三医院药学部，加味济生肾气汤药物组成：肉桂6 g、制附片8 g、熟地黄15 g、山药25 g、山茱萸15 g、茯苓20 g、泽泻8 g、牡丹皮8 g、怀牛膝15 g、车前子10 g、黄芪25 g、熟大黄8 g、桃仁10 g。取水1000 mL浸泡药材，文火煎煮30～40 min，留200 mL药液备用。

伊红、苏木素染液购自北京索莱宝科技有限公司；二甲苯、无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；羟苯磺酸钙片购自南京长澳制药有限公司；α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin，SMA)、母亲DPP同源物3(mother against decapentaplegic homolog 3，Smad3)、I型胶原(collagen type I，Col-I)、Col-III、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自武汉Bioswamp。

1.2 动物分组处理

所有大鼠适应性喂养7 d后，随机分为对照组、模型组、羟苯磺酸钙组及加味济生肾气汤低、中、高剂量组，每组11只。对照组大鼠采用普通饲料正常喂养；模型组及各药物治疗组大鼠喂养高糖高脂饲料5周后，禁食12 h，STZ腹腔注射，25 mg/(kg·d)，连续3 d。造模成功后，加味济生肾气汤低、中、高剂量组大鼠分别予以加味济生肾气汤1、4、10 mL/(kg·d)灌胃处理；羟苯磺酸钙组大鼠羟苯磺酸钙100 mg/(kg·d)灌胃处理；对照组及模型组等体积0.9%氯化钠注射液灌胃处理；各组大鼠连续灌胃6周，1次/d。

1.3 HE染色

大鼠肾脏组织脱水、包埋、切片。经苏木精染液染核7 min后流水冲洗2 h。1%的盐酸乙醇分化3 s，伊红染液染色5～10 min。用95%乙醇和无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4 Masson染色

肾脏组织脱水、包埋、切片。经苏木精染核5～10 min，充分水洗，Masson丽春红酸性复红液染色5～10 min，冰醋酸水溶液浸洗，分化。苯胺蓝染色，浸洗。脱水透明后封固。

1.5 ELISA检测

绘制标准曲线，设标准品孔，加标准品，加样，加抗体。加入酶标试剂，封板后温育。揭板膜，弃去液体，甩干，洗涤静置，如此重复5次，拍干。加显色剂轻轻震荡混匀，避光显色后加终止液，检测450 nm处的吸光度。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 肾组织HE染色

HE染色结果显示对照组肾脏组织结构清晰，形态规则，未见明显病理变化。模型组肾小球体积增加，系膜细胞和系膜基质增生，系膜区变宽，基底膜增厚，毛细血管环增多，肾小球系膜区大量炎性细胞浸润；肾小管上皮细胞肿胀、融合、坏死。羟苯磺酸钙组及加味济生肾气汤中、高剂量组肾组织形态均得到不同程度改善。见图1。

A为对照组，B为模型组，C为羟苯磺酸钙组，D、E、F分别为加味济生肾气汤低、中、高剂量组图1 各组大鼠肾组织HE染色(×200)

2.2 肾组织Masson染色

Masson染色结果显示对照组肾小球、肾小管结构未见异常。与对照组比较，模型组和加味济生肾气汤低剂量组肾小管间质和肾小球周围呈现胶原堆积，存在明显纤维化现象。与模型组相比，羟苯磺酸钙组及加味济生肾气汤中、高剂量组肾小管间质纤维化程度降低。见图2。

2.3 肾组织α-SMA及VEGF水平比较

与对照组比较，模型组大鼠肾组织α-SMA、VEGF水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较，羟苯磺酸钙组及加味济生肾气汤高剂量组大鼠肾组织α-SMA、VEGF水平著降低(P<0.05)。见图3。

与对照组比较*P<0.05，与模型组比较#P<0.05；A为对照组，B为模型组，C为羟苯磺酸钙组，D、E、F分别为加味济生肾气汤低、中、高剂量组图3 各组大鼠肾组织α-SMA及VEGF水平比较

2.4 肾组织Smad3、TGF-β、Col-III及Col-I水平比较

与对照组比较，模型组大鼠肾组织Smad3、TGF-β、Col-III及Col-I水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较，羟苯磺酸钙组及加味济生肾气汤低、中、高剂量组大鼠肾组织Smad3、TGF-β、Col-III、Col-I水平均显著降低(P<0.05)。见图4。

与对照组比较*P<0.05，与模型组比较#P<0.05;A为对照组，B为模型组，C为羟苯磺酸钙组，D、E、F分别为加味济生肾气汤低、中、高剂量组图4 各组大鼠肾组织Smad3、TGF-β、Col-III及Col-I水平比较

3 讨论

DN是一种临床常见的糖尿病慢性微血管并发症，在高血糖的长期作用下，肾脏结构和功能发生变化，从而导致蛋白尿、高血压和肾功能进行性降低。肾间质纤维化为各种肾脏疾病进展到终末期的共同途径和主要病理基础，由各种原因引起的细胞外基质在肾间质过度沉积和间质成纤维细胞增生而形成[5]。该过程中，肌成纤维细胞是合成细胞外基质的主要细胞，而部分肌成纤维细胞是由小管上皮细胞转化而来，即为小管上皮细胞转分化。近年来研究发现，TGF-β/Smad信号通路在肾纤维化的发生、发展中起重要作用[6-7]。

α-SMA是肾小管上皮细胞转分化过程中的重要标志物，由肌成纤维细胞表达。曲良卓[8]指出，可将血浆VEGF MIC-1及尿LAP作为诊断2型糖尿病肾病的检测指标。研究[9]表明，VEGF是判断DN早期病变程度的重要指标，并具有促炎促纤维化作用[10]。本研究结果显示，加味济生肾气汤高剂量组大鼠的肾脏纤维化指标α-SMA和VEGF水平显著低于模型组，提示加味济生肾气汤对DN大鼠肾脏纤维化有一定的抑制作用，这一结论在HE染色和masson染色结果中也得到了相应的验证。

TGF-β1是公认的致纤维化因子，能通过多种信号通路诱导肾小管上皮细胞转分化[11]。Col-I和Col-III是细胞外基质的主要组成部分，TGF-β1可诱导其表达上调；当TGF-β1受到抑制时，Col-I和Col-III表达也随之减少[12]。本研究结果显示，加味济生肾气汤中、高剂量组大鼠肾脏组织的TGF-β、Smad3、Col-III和Col-I水平显著低于模型组，提示加味济生肾气汤可能通过下调TGF-β表达，影响TGF-β/Smad通路，进而对DN大鼠肾脏纤维化病程进展产生抑制作用。丁斗等[13]研究发现，济生肾气丸加味可下调急性肾损伤大鼠的炎症细胞因子表达，减缓成纤维细胞纤维化进程，与本研究结果相一致。

综上所述，加味济生肾气汤可减缓糖尿病肾病大鼠的肾脏纤维化进程，其作用机制可能与调节TGF-β/Smad信号通路有关。