原浆啤酒发酵过程中蛋白质和总糖含量的变化

米 智，刘荔贞，武晓红，李旭东

（1.山西大同大学生命科学学院，山西大同 037009；2.山西大同大学化学与化工学院，山西大同 037009）

啤酒是以大麦芽或添加辅料，啤酒花和水为主要原料，经过酵母菌发酵酿制而成的，含有大量CO2、酒精。原浆啤酒是不加水，不经过滤，不经灭活工序，保留鲜活酵母的生啤酒原液。啤酒具有良好的口感，素有液体面包美称而颇受消费大众的喜爱[1]。

啤酒风味主要有：闻到的香气（aroma）、尝到的口味（taste）和感觉到的口感（mouthfeel）[2]。消费者选择啤酒的主要依据是酒味、口感和性价比，口感成了消费者关注的重要质量参数之一[3]。化学成分决定了啤酒的质量品质和风味特色[3]。高级醇类和酯类物质对啤酒特有的风味和香气有着至关重要的作用[4]，如乙酸乙酯、异戊酯乙酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯负责为“水果味”味道[5]。它们之间巧妙的平衡协调关系，便形成了啤酒独特的风格。啤酒的苦涩味主要来源于酒花中的树脂，还有部分来自酵母酿造过程的苦味肽、氨基酸、多酚等非酒花成分的共同作用[6-7]。也有文献报道称，啤酒的风味和香气与二氧化碳压力具有相关性[8-9]。啤酒中所有风味活性成分都是由酵母菌生命代谢活动产生的，这些化合物决定啤酒的最终质量[10]。

适量饮用啤酒，可降低冠心病等心脏病的发病率，降低糖尿病的死亡率等[11-12]。啤酒还具有抗菌作用和预防骨质疏松和动脉硬化，调节肠道生态平衡，增强机体免疫力，控制血清中的胆固醇等功能[13]。

本研究跟踪山西大同大学生物工程试验中心啤酒酿造和发酵整个过程，利用生物化学检测从麦芽醪进罐第1 d 到成品原浆啤酒出酒期间蛋白质和总糖含量变化情况，期望找到二者含量随时间变化的规律；成品酒出酒后，与市场常见品牌啤酒进行比较，以期为该试验中心酿酒工艺改良提供参考及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠，重庆地茂化工试剂有限公司；结晶酚，西安天茂化工有限公司；亚硫酸钠，济宁宏明化学试剂有限公司；碘、碘化钾、葡萄糖，天津光复科技发展有限公司；酚酞，无锡市亚泰联合化工有限公司；磷酸，北京世纪拓鑫精细化工有限公司；95%乙醇、氢氧化钠、考马斯亮蓝、牛血清白蛋白，上海源叶生物科技有限公司。以上试剂均为分析纯。原浆成品啤酒由山西大同大学生物工程试验中心提供，市售常见品牌啤酒：易拉罐装雪花、哈尔滨和纯生啤酒，均为每听330 mL。

1.2 仪器与设备

山西大同大学生物工程试验中心100 L 小试原浆啤酒生产线、糖度仪，山东济南豪鲁机械设备有限公司；BS600H 精密电子天平，太原世成衡器有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅，常州市金坛友联仪器研究所；722N可见分光光度计，大尼科（上海）仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 自酿原浆啤酒生产工艺

参考米智等[1]原浆酒生产过程及工艺流程。

1.3.2 总糖含量的测定

（1）葡萄糖标准曲线制作

相关报道称，3,5-二硝基水杨酸分光光度法用于测定食品中总糖含量基本可行且准确性较高[14-15]。本文测定总糖采用武平[16]和张龙翔[17]的方法，以葡萄糖制作标准曲线，求得线性回归方程。

取干燥洁净的试管8支，编号0～7，按顺序分别加1 mg/mL 标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，加蒸馏水补充至2 mL，再分别加DNS 试剂1.5 mL，沸水浴5 min，冷却至室温，加21 mL蒸馏水混合均匀后，以0 号管为对照，在540 nm 下测定各管吸光度，并绘制标准曲线。

（2）啤酒总糖的测定

原浆啤酒发酵过程大约需要14 d 时间，故该实验总糖检测从麦芽醪进发酵罐第1 d 开始，到成品酒出酒为止，每天同一时间同一发酵罐取样，尽可能做到实验间隔24 h，做平行实验3 次。总糖测定方法同葡萄糖标准曲线绘制，数据处理公式：

总糖浓度=m×V-1×n×0.9/1000

式中：m为反应液中总糖的质量（mg）；V为反应液的体积（mL）；n为稀释倍数；0.9为糖苷键在断裂时需要加一分子水；1 000 是mg 与g 之间的转化倍数；总糖含量的最后单位为g/mL。

1.3.3 蛋白质含量的测定

参照Bradford 改良方法[18]，以牛血清白蛋白制作标准曲线。啤酒样本预处理方法见文献[19]。

2 结果与分析

2.1 总糖含量

2.1.1 原浆啤酒发酵过程中总糖含量

根据葡萄糖标准曲线所得方程为：y＝0.1848x-0.0123（x为葡萄糖浓度，y为该葡萄糖浓度下的吸光值），R2=0.9916，计算麦芽醪中总糖浓度（mg/mL）。

图1是麦芽醪进入发酵罐连续发酵14 d总糖含量的变化趋势，第1 d的总糖量最高，约为94.2 mg/mL。第2～4 d总糖含量成下降趋势，而且明显糖含量低于第1 d，约在42.8～54.2 mg/mL 之间。在之后的10 d 内，总糖含量约在6.7 mg/mL 上下波动，大致呈先升高后降低，再升高最后降低的变化态势。总体上，总糖在麦芽醪发酵过程中显著降低，在出酒时的总糖含量约为2.7 mg/mL。

图1 麦芽醪连续发酵14d总糖含量变化

2.1.2 原浆成品啤酒与市售啤酒总糖含量比较

比较自酿原浆成品啤酒与3种常见市售啤酒的总糖含量，发现原浆成品啤酒总糖含量最高约为11.9 mg/mL，燕京啤酒含量最低约为8.4 mg/mL，而哈尔滨啤酒和纯生啤酒居于二者中间，分别为9.4 mg/mL和10.5 mg/mL。

啤酒麦芽醪当中，以糖类物质为主，约占90%，其中可发酵性单糖占总糖类物质的10%左右，二糖中蔗糖约占5%，麦芽糖约占45%～50%，麦芽三糖、棉子糖等三糖物质约占10%～15%，DP4-8 的寡糖约占20%～25%，还有少量的戊糖和戊聚糖等五碳糖、β-葡萄糖、异麦芽糖，约占3%～5%[20]。能被酵母菌发酵的糖类称为“可发酵糖”。麦芽四糖以上的寡糖、戊糖、异麦芽糖等均不能发酵，故它们会一直存在于啤酒当中，成为啤酒浸出物的主体[21]。此外，麦芽汁当中各种糖的浓度也会影响酵母菌的发酵，存在着“葡萄糖阻遏效应[22-23]”、“巴士德效应[21]”和“克拉勃脱效应[21]”等，影响糖的分解代谢，故自酿原浆啤酒的总糖含量高于其他市售啤酒。

2.2 蛋白质含量

2.2.1 自酿啤酒发酵过程中蛋白质含量

根据蛋白质标准曲线所得方程为：y=0.8376x+0.0417（x为蛋白质浓度，y为该浓度下的吸光值），R2=0.9901，计算麦芽醪中蛋白质浓度（mg/mL）。

图2 是麦芽醪进入发酵罐连续发酵14 d 蛋白质含量的变化趋势。从第1 d到第3 d，蛋白质含量呈下降趋势。第4 d 到第7 d，蛋白含量又呈现上升趋势，蛋白质含量略高于前3 d。在随后的1 周时间内，蛋白质含量变化出现2 个极大值，分别是第9 d（约为2.0 mg/mL，同时也是发酵期间的最大值）和第13 d。纵观整个发酵期间，蛋白质含量的最低值为发酵第3 d，约为1.1 mg/mL。

图2 麦芽醪连续发酵14 d蛋白质含量变化

2.2.2 原浆成品啤酒与市售啤酒蛋白质含量比较

通过测定不同品种啤酒及自酿原浆成品啤酒蛋白质含量，发现自酿啤酒蛋白质含量最高约为1.4 mg/mL，燕京啤酒含量最低约为0.6 mg/mL，而哈尔滨啤酒和纯生啤酒居于二者中间，分别为0.8 mg/mL和0.7 mg/mL。啤酒蛋白质在很大程度上影响起泡性能[24]。蛋白质被分解后产物中有氨基酸和多肽，而多肽物质或蛋白质的存在是形成悬浮物或（和）沉淀物的前驱物质。因此蛋白质含量的多少将直接影响到啤酒非生物稳定性，进而影响啤酒的质量[25]。

3 结论与讨论

从整个发酵过程来看，总糖含量呈下降趋势，尤其前4d最为明显。后10d总糖含量呈现波动态势，可能与麦芽醪中糖的种类有关。

自酿原浆啤酒的总糖含量明显高于其他3种，原因可能有：①自酿原浆啤酒没有经过过滤，成品酒会含有多种酵母菌不能发酵的糖类；②在酿酒过程中没有添加任何酶制剂去水解相关的糖类，仅仅靠发芽的大麦自身水解酶系去完成各种糖类的分解，可能不是很彻底。

啤酒发酵初期，接种后的酿酒酵母只能通过吸收麦芽醪中的含氮物质，自身繁殖扩增，因此发酵初期麦芽汁中的蛋白质含量会降低，随后呈现波动趋势。酵母菌的生命活动代谢均是以麦芽醪中的各种营养物质为基础，涉及糖、蛋白质和脂类三大代谢通路，还有很多种风味化学物质，也是一些氨基酸或含氮化合物通过酵母菌转化而来。因此，糖和蛋白质含量在整个发酵过程含量变化与酵母菌的种类、代谢活动、发酵条件等紧密相关。