基于网络药理学和分子对接探讨桃红四物汤治疗类风湿关节炎的作用机制

赵晶晶　郑福增　周子朋　张安琪　郭嘉

摘要 目的：运用网络药理学和分子对接技术探讨桃红四物汤治疗类风湿关节炎的作用机制，为临床应用提供理论依据。方法：运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索桃红四物汤的有效成分及作用靶点，通过GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb、DrugBank数据库收集疾病相关靶点。运用Cytoscape 3.6.1软件构建“化合物-靶点”网络，借助STRING平台构建交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并使用Cytoscape对网络进行拓扑分析，获取核心基因，通过R语言进行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，最后将核心基因与主要活性成分进行分子对接验证。结果：TCMSP检索得到桃红四物汤治疗RA的有效成分41个，对应靶点154个;拓扑分析得到AKT1、JUN、TP53、MMP9、MAPK14等10个核心基因。GO富集分析共涉及生物过程（BP）2 316个，细胞组分（CC）75个，分子功能（MF）205个，KEGG通路富集分析筛选得到158条与RA相关通路，主要涉及P13K-AKT、白细胞介素17、肿瘤坏死因子等信号通路，集中调控炎症、血管翳形成、细胞增殖与凋亡等。分子对接结果表明，主要活性化合物能够分别与核心靶点结合，并展现出较好的亲和力。结论：本研究对桃红四物汤治疗RA的多成分、多靶点、多通路的作用与机制进行初步探讨，可为后续基础研究提供参考，为临床应用提供理论依据。

关键词 类风湿关节炎;桃红四物汤;网络药理学;分子对接

Study on the Mechanism of Taohong Siwu Decoction in the Treatment of Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHAO Jingjing1， ZHENG Fuzeng2， ZHOU Zipeng2， ZHANG Anqi1， GUO Jia1

（1 Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450000， China; 2 Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou 450000， China）

Abstract Objective：To explore the possible mechanism of action of Taohong Siwu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritis by using network pharmacology and molecular docking technology， so as to provide theoretical basis for clinical application.Methods：TCMSP was used to retrieve the effective components and targets of Taohong Siwu Decoction， and disease-related targets were collected from GeneCards， OMIM， TTD， PharmGkb and DrugBank databases.Cytoscape 3.6.1 track software was used to build “compound-targets” network.With the help of the STRING intersection target protein interaction network， and Cytoscape was used for network topology analysis， and the core genes was obtained.By R language， GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis were conducted.Finally， molecular docking verification of core genes and main active ingredients performed molecular docking verification.Results：It was predicted that there were 41 active components and 154 corresponding targets in the treatment of RA by Taohong Siwu Decoction.Topological analysis revealed AKT1， JUN， TP53， MMP9， MAPK14 and other 10 core genes.GO enrichment analysis involved biological process（BP） 2 316， 75 cell components（CC）， molecular function（MF） 205， KEGG pathway enrichment analysis filter to get 158 RA related pathways， mainly involving P13K-AKT， interleukin 17， tumor necrosis factor signaling pathways and other pathway， such as centralized control inflammation， pannus formation， cell proliferation and apoptosis， etc.The results of molecular docking showed that the main active compounds can bind to the core targets respectively and exhibit good affinity.Conclusion：In this study， the effect and mechanism of Taohong Siwu Decoction in the treatment of RA with multiple components， multiple targets and multiple pathways were preliminarily discussed， so as to provide reference for subsequent basic research and theoretical basis for clinical application.

Keywords Rheumatoid arthritis;Taohong  Siwu Decoction;Network Pharmacology; Molecular Docking

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.004

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以滑膜增生和炎症为特征的自身免疫性疾病，可发病于任何年龄段[1]。RA在世界范围内的发病率在0.5%～1%之间，是成人最常见的慢性炎症疾病之一[2]。RA不仅导致患者身体功能和生命质量下降，而且给患者家庭和社会带来巨大的经济负担[3]。因此，如何更有效地控制RA并延缓其发展成为医学研究的热点。

中医药在治疗RA有着悠久的历史和丰富的经验。研究表明，中医药能有效缓解疼痛、消除肿胀、改善功能障碍、减轻骨侵蚀、提高生命质量等，在治疗RA方面起重要作用[4]。桃红四物汤源于《医宗金鉴》，该方以强劲的破血之品桃仁、红花为主，力主活血化瘀，辅以四物汤养血活血。药理研究显示桃红四物汤具有抗炎、免疫调节、促进骨折愈合等作用，临床治疗RA疗效显著[5-7]。然而桃红四物汤治疗RA的药理学机制尚不明确。本研究基于网络药理学与分子对接方法，全面阐释桃红四物汤治疗RA的主要活性成分、潜在靶标和关键通路，为临床用药和基础研究提供理论参考。

1 資料与方法

1.1 药物活性成分及靶点筛选 中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索桃红四物汤（桃仁、红花、当归、川芎、芍药、熟地黄）有效活性成分及其对应靶点，筛选条件为口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-Like，DL）≥0.18。并通过人类蛋白质数据库（UniProt Database，https：//www.uniprot.org/）将靶基因名称规范为官网名称。

1.2 疾病相关靶点 以“Rheumatoid Arthritis”为检索词，应用人类基因数据库（GeneCards，https：//genealacart.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//www.omim.org/）、治疗靶标数据库（TTD，http：//http：//db.idrblab.net/ttd/）、药物基因组学知识库（PharmGkb，https：//www.pharmgkb.org/）、药物和疾病数据库（DrugBank，https：//go.drugbank.com/）进行检索，获得RA相关靶点。

1.3 药物与疾病交集靶点筛选及“化合物-靶点”网络构建 利用R语言将化合物潜在靶点与疾病靶点取交集，获得桃红四物汤治疗RA的交集靶点。由Cytoscape3.6.1绘制“活性成分-靶点”网络图，节点（Node）代表有效活性成分或靶点、边（Edge）代表节点间的相互关系。本研究通过自由度（Degree）的大小来分析网络中的节点，节点的自由度值越大，则其在网络中的地位越重要，说明其参与的生物功能越多，生物学重要性越强[8]。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建和核心靶标筛选 将交集基因上传至STRING平台（https：//string/db.org/）构建共同靶点PPI网络，选择“Multiple Proteins”模式，蛋白种属设为“Home Sapiens”，最小互作分数值为0.9，其他参数保持默认，获得PPI网络，构建PPI网络模型。然后将所得文件导入Cytoscape 3.6.1，利用插件CytoNCA计算每个节点的打分，筛选打分较高的节点再次构建网络，从而得出PPI网络中核心基因。

1.5 GO和KEGG富集分析 将交集靶点导入R语言，进行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析由生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3个部分组成。以P<0.05作为筛选标准，并对富集分析结果进行可视化处理。

1.6 主要活性成分-靶点分子对接 为验证筛选出的桃红四物汤治疗RA的可能关键靶点的准确性，将调控网络度值靠前的活性成分与PPI网络拓扑得到的核心的靶点进行分子对接。在PDB蛋白数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下载核心靶点蛋白结构;在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载化合物结构。使用Autodock Vina软件进行分子对接。

2 结果

2.1 桃红四物汤有效成分及靶点 筛选得到61个有效成分，其中川芎7个，当归2个，红花22个，芍药13个，生地黄2个，桃仁23个，共同8个。在Uniprot数据库中找到对应基因名的靶点有208个。

2.2 桃红四物汤治疗RA作用靶点预测 通过检索GeneCards、OMIM、TTD、Pharmgkb、DrugBank数据库删除重复值后得到4 614个疾病相关靶点。利用R语言得到桃红四物汤治疗RA的潜在基因154个。见图1。

2.3 “化合物-靶点”网络分析 利用Cytoscape 3.6.1软件构建“活性成分-靶点”网络。见图2。正方形代表化合物，其中绿色代表桃仁，红色代表川芎，深蓝色代表红花，浅蓝色代表当归，青色代表芍药，紫色代表熟地黄，黄色代表桃红四物汤治疗RA的靶点。分析网络可知，该图包括195节点和374条边。Degree较高的化合物分别是槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）、黄芩素（Baicalein）、胡萝卜素（Carotene）、谷固醇（Beta-Sitosterol）等。

2.4 PPI网络构建和核心靶点筛选 将筛选得到的桃红四物汤治疗RA的154个基因上传至String数据库进行PPI分析，并保存CSV文件。见图3。将CSV文件导入Cytoscape3.6.1软件并利用CytoNCA插件进行拓扑分析，筛选得到的基因有AKT1、JUN、TP53、MAPK14、MMP9等。见图4。

2.5 生物过程和通路富集分析 通过R语言对交集靶点进行GO和KEGG富集分析，分析发现，GO富集分析主要涉及氧化反应、对脂多糖等2 316条生物过程，膜筏、膜微结构域等75条细胞组分，DNA-结合转录激活因子活性、血红素结合等205条分子功能;KEGG通路富集分析共涉及158条目，主要包括PI3K-AKT信号通路、乙型肝炎信号通路、前列腺癌信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路。并根据靶点数及P值分别筛选前30条目绘制气泡图。见图5。气泡图中颜色深浅代表P值的大小，颜色越深，P值越小，相关性越大。气泡的大小代表富集条目的靶点数目，气泡越大说明对应的靶点越多。并根据排名找到这些靶点最关键的PI3K/AKT信号通路，同时用红色表示药物靶点在该信号通路上具体作用点。见图6。

2.6 分子对接验证结果 将“活性成分-靶点”网络图中度值前3的活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚与拓扑分析得到的关键靶点AKT、JUN、MAPK14对接，对接得分表1。利用Pymol软件对结果进行输出优化。见图7。最低结合能越低，靶蛋白與活性成分之间结合活性度越高，说明二者之间结合能力越好[9]。结果表明靶蛋白与主要有效成分具有较强的结合能。

3 讨论

RA属于中医“痹症”“尪痹”“历节”等范畴。该病是由于机体正气虚弱、卫外不固、邪气入侵，导致经络痹阻不通、气血瘀滞，从而出现关节肿胀疼痛、畸形、活动受限等临床表现的一类病症。多数医家认为瘀血既是RA的重要病因之一，又是重要的病理产物之一，强调活血化瘀法在类风湿关节炎的治疗中十分重要[10]。经现代药理研究证实，活血化瘀法可改善毛细血管通透性，减少炎症渗出，改善血液循环，促进炎症吸收，红四物汤以祛瘀为核心，辅以养血、行气，临床用于治疗类风湿关节炎疗效显著[6，11]。

本研究通过网络药理学的科学技术，对桃红四物汤治疗RA的机制进行研究，发现桃红四物汤有效成分通过减轻炎症、抗氧化、抑制破骨细胞活性等途径发挥治疗RA作用。通过分析得到最主要的活性成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素、胡萝卜素、谷固醇、杨梅酮、豆固醇等。大量研究表明，槲皮素不仅可以通过抑制免疫细胞分泌炎症介质（IFNg、TNF-α、IL-2等），还可通过抑制与核因子κB相关的基因表达来抑制炎症介质的分泌[12]。Lou等[13]研究证实木犀草素具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤的活性作用，并且木犀草素还能影响滑膜成纤维细胞的增殖和功能，下调降解酶活性，影响金属蛋白酶和细胞因子的表达，从而发挥治疗RA作用。Lee等[14]通过实验发现，在胶原诱导的关节炎小鼠中，与对照组比较，山柰酚给药减轻了关节炎的发病频率和严重程度，证实山柰酚在体外和体内降低了破骨细胞化，并与破骨细胞标志物的抑制有关。

本研究根据核心靶点属性参数，结合GO和KEGG分析，可知桃红四物汤治疗RA主要涉及AKT1、JUN、TP53、MAPK14等核心靶点，P13K-AKT、流体剪应力与动脉粥样硬化、AGEs/RAGE、乙型肝炎等信号通路调控RA。PI3K是一种参与细胞生长及骨架重塑的重要磷脂酰肌醇激酶，也是重要的抗凋亡调节因子，活化后可导致脂质底物磷酸化并激活下游AKT，通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Caspase3、核因子κB、mTOR等，参与调节细胞凋亡与代谢过程[15-16]。许多研究表明，PI3K-AKT信号通路作为细胞内主要的信号传导途径之一，广泛存在于滑膜中，与RA-FLS的活化、黏附、血管生成和基质降解密切相关[17]。PI3K-AKT信号通路是RA发生发展中的重要因素，PI3K蛋白家族可被多种细胞因子激活，在细胞分化、代谢、炎症、细胞活力和诱发癌症发挥重要作用[18]。

有实验证实JUN蛋白在RA的发生发展中起着重要作用，在胶原诱导的小鼠关节炎模型中，使用一种新的抑制剂抑制滑膜成纤维细胞中JUN的表达，可减轻小鼠骨侵蚀症状[19]。VEGF是RA病理性血管新生的重要诱导剂，导致血管新生，形成血管翳，引起骨、软骨和关节的破坏[20]。

陈英等[21]研究发现RA并发动脉粥样硬化患者中炎症介质TNF-α、IL-6、IL-17明显升高。它们参与内皮细胞活化，是RA滑膜组织中形成血管翳的关键步骤，也是动脉粥样硬化性CVD的发病机制，内皮活化诱导细胞表达趋化因子和黏附分子，使白细胞迁移到关节腔或血管内膜，进一步促进中性粒细胞活化，从而导致局部炎症形成和发展[22-23]。

通过分子对接可以看到配体和受体的结合能均≤-6 kcal/mol，结合位点均有稳定的氢键和疏水键，构象稳定，对接最稳定的是槲皮素、木犀草素与AKT1的结合（-9.8 kcal/mol）。分子对接结果表明桃红四物汤活性成分与受体蛋白稳定结合，起到治疗RA的作用。

综上所述，桃红四物汤治疗RA具有多靶点、多途径、多通路的特点，本研究不仅为临床应用治疗提供了科学依据，而且为探索新的治疗方法提供了思路。

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（2020-11-06收稿 责任编辑：魏庆双 徐颖）

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（81804050）;2018年度河南省中医药科学研究重点课题（2018ZY1011）

作者简介：赵晶晶（1995.11—），女，硕士研究生在读，研究方向：中医药防治风湿病，E-mail：zjj951108@163.com

通信作者：郑福增（1962.09—），男，学士，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中医药防治风湿病，E-mail：zhengfuzengyx@126.com