基于网络药理学的逍遥散治疗痤疮的作用机制

2021-08-23陈逴凡李红毅杨贤平李玉清

世界中医药 2021年12期

陈逴凡　李红毅　杨贤平　李玉清

摘要目的：通過网络药理学方法探究逍遥散治疗痤疮的主要活性成分及其作用机制。方法：应用中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）筛选逍遥散中含有的有效成分及其作用靶标，并从基因表达综合数据库（GEO）中提取痤疮相关靶标。使用Cytoscape软件及其bisogenet插件构建逍遥散治疗痤疮的“化合物-靶点”网络，并绘制药物活性成分-靶蛋白-疾病蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，再分次进行拓扑分析，得出核心网络。采用R语言软件中ClusterProfiler数据包对逍遥散的潜在作用基因靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，并进行可视化作图。结果：通过TCMSP，获得了逍遥散有效活性成分161个，潜在作用靶点2 619个，与146个痤疮相关靶点的共同靶点为37个，包括PTGS2、CCNA2、CHEK1、NR3C2等，潜在活性成分为木犀草素、槲皮素、异鼠李素等110个。GO和KEGG富集分析结果显示，逍遥散治疗痤疮主要通过脂多糖应答、细菌源性分子应答等作用机制，与肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、P53信号通路、核因子κB信号通路等相关。结论：本研究通过网络药理学的方法验证了逍遥散治疗痤疮的多成分、多靶点、多通路的作用机制特点，简单阐述了逍遥散治疗痤疮潜在有效成分及作用通路，为后续的相关研究提供理论支持。

关键词逍遥散;痤疮;中医药;网络药理;蛋白质;靶点;通路;作用机制

Study on Mechanism of Xiaoyao Powder in Treatment of Acne Based on Network Pharmacology

CHEN Chuofan1，LI Hongyi2，YANG Xianping1，LI Yuqing1

（1 The Second Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China; 2 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine/Department of Dermatology，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China）

Abstract Objective：To investigate the main active components and mechanism of Xiaoyao Powder in the treatment of acne based on network pharmacology.Methods：The effective components and their targets in Xiaoyao Powder were screened by Pharmacological Database and Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），and acne related targets were extracted from gene expression database（GEO）.The “compound target” network of Xiaoyao Pills was constructed by using the software of Cytoscape and bisogenet plugin.The PPI network of active ingredients，target proteins and diseases was drawn by using the software of Cytoscape and its bisogenet plug-in.The network topology analysis was carried out again，and the core network was obtained.Using ClusterProfiler data package in R language software，GO and KEGG analysis of potential gene targets of Xiaoyao Powder were performed and visualized mapping was performed.Results：A total of 161 active components and 2619 potential targets of Xiaoyao Powder were obtained from TCMSP.There were 37 common targets with 146 acne related targets，including PTGS2 CCNA2 CHEK1 NR3C2，etc.The 110 potential active ingredients were luteolin，quercetin，isorhamnetin，etc.The results of enrichment of GO and KEGG showed that the mechanism of Xiaoyao Powder in the treatment of acne was mainly concentrated in response to lipopolysaccharide and response to molecule of bacterial origin，mainly related to tumor necrosis factor signaling pathway，IL-17 signaling pathway，P53 signaling pathway，NF kappa B signaling pathway，etc.Conclusion：This study revealed the mechanism of Xiaoyao Powder in the treatment of acne through multi-component，multi-target and multi-channel，and makes a brief description of the potential effective ingredients and action pathways of Xiaoyao Powder in the treatment of acne，providing theoretical support for follow-up related research.

Keywords Xiaoyao Powder; Acne; Traditional Chinese medicine; Network pharmacology; Protein; Target; Pathway; Mechanism of action

中图分类号：R289.4;R751文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.002

痤疮，中医称之为“粉刺”，是多发于青春期的慢性炎症性毛囊皮脂腺疾病，临床非常常见。痤疮为损美性皮肤病，多发于面部，不仅病程持续时间长且多反复，很容易影响患者日常的社交生活并引起各种心理问题[1-2]。现代医学治疗痤疮大都通过抗感染、抑制油脂分泌、激素治疗等方法，若能配合中医辨证论治，往往可以达到更好的治疗效果[3]。逍遥散出自明代著名医籍《太平慧明和剂局方》，其组成包括：当归、白芍、柴胡、茯苓、白术、甘草、生姜、薄荷，为和解剂，全方具有疏肝养血理脾之功，对肝郁脾虚证、冲任失调证痤疮患者的治疗效果明显。本研究利用网络药理学方法，对逍遥散中药物的有效成分和逍遥散治疗痤疮的分子作用靶点、细胞信号通路等方面进行探索，旨在揭示其分子作用机制，为今后相关的研究奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 逍遥散有效成分及作用靶点的获取与筛选从中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中分别获取柴胡、当归、白芍、茯苓、白术、甘草、生姜、薄荷的有效化学成分及相应分子作用靶点。分别输入需要检索的药物名称至检索框，检索出其所有药物化学成分，再设置筛选条件为OB≥30%，DL≥0.18，得到药物的潜在有效成分。口服生物利用度（OB）和类药性（DL）是评判药物有效利用度的相关指标，一般认为OB≥30%且DL≥0.18的药物化学成分可被认为该药物的有效成分[4]。

1.2 痤疮相关靶基因的确定在基因表达综合数据库（GEO;https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，以“acne”为检索词进行检索，限定的检索条件为“series”“expression profiling by array”“homo sapiens”，获取痤疮有关的人类基因组研究，并从微阵列数据GSE6475中提取出痤疮患者皮损处活检和无痤疮对照组活检之间的主要差异表达基因（DEG），以终止值为P<0.05，倍数变化logFC>1去除重复项，并将这些已知的靶点和DEGs视为与痤疮相关的基因。

1.3 逍遥散化合物-靶点網络的构建筛选出逍遥散有效成分的作用靶点和痤疮相关的靶基因中重合的部分，确定逍遥散治疗痤疮的潜在靶点，并利用Cytoscape软件制作逍遥散对于痤疮治疗的“药物化合物-疾病基因靶点”网络图。

1.4 化合物-疾病-相关蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建使用Cytoscape软件，把逍遥散和痤疮的共同靶基因输入于bisogenet插件中，通过DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT、BIND数据库，绘制化合物-疾病-相关PPI网络。运用CytoNCA插件对该PPI网络进行相关拓扑分析，以DC>61、BC>600为筛选条件进一步精简PPI网络，最终得到逍遥散-痤疮-相关PPI核心网络。

1.5 基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析通过R语言软件（Rx64 3.6.1）中ClusterProfiler数据包，把逍遥散治疗痤疮的潜在靶基因导入Enrichr数据库中，并进行GO及KEGG富集分析，得到药物作用的关键靶点及参与的生物过程，并使用R语言软件作图。

2 结果

2.1 逍遥散有效成分及作用靶点共筛出逍遥散的药物有效成分为161个，其中白芍13个，白术7个，薄荷10个，柴胡17个，当归2个，生姜5个，茯苓15个，甘草92个。根据逍遥散有效成分，应用TSMSP数据库，共检索得到潜在的作用靶点2 619个。

2.2 痤疮相关靶基因应用GEO数据库，从基因芯片数据GSE6475中提取12 549个基因，使用R语言软件，得到差异基因（DEG）146个，其中患病后基因较对照组表达升高的127个，较对照组降低的19个。其中红色节点代表痤疮患者与正常对照组比较表达上调的基因，绿色节点为表达下调的基因。见图1。

2.3 化合物-靶点网络将逍遥散筛选出的潜在作用靶点（2 619个）与痤疮相关靶基因（146个）做韦恩分析，得到共同靶点37个，包括PTGS2、CCNA2、CHEK1、NR3C2等，110个有效化合物作用于共同靶点。在获得共同靶点基础上，使用Cytoscape软件，建立“化合物-靶点”的中药复方调控网络模型，如图2所示，其中圈内浅绿色矩形节点为药物作用靶点，外两圈椭圆形节点为化合物，节点的颜色不同代表该成分存在于不同的中药当中，紫色节点为甘草，黄色节点白芍，天蓝色节点为白术，绿色节点为薄荷，靛蓝色节点为柴胡，粉色节点为茯苓，灰色节点为生姜，红色节点为化合物存在于多种中药当中。

其中作用于较多基因靶点的化合物如表1所示。

2.5 化合物-疾病-相关PPI网络通过Cytoscape软件，将逍遥散及痤疮共有靶点输入bisogenet插件，应用相关网络数据库，进行PPI网络分析，初步绘制药物活性成分-疾病-相关PPI网络得到初始PPI网络共1 473个节点，29 437条边。再运用CytoNCA插件进行网络拓扑分析，得到共303个节点，10 517条边的PPI网络图，再进行二次筛选得到共25个节点，193条边的PPI核心网络。拓扑分析过程如图3所示。由图中可知，痤疮相关核心蛋白包括HSPA8、CDK2、NPM5等。

2.6 GO功能富集分析利用R语言软件，将37个逍遥散有效成分作用靶点和痤疮相关靶基因的共同靶点输入Enrichr数据库进行基因功能注释分析（GO分析），包括生物学过程（BP）、分子功能（MF）以及细胞组分（CC）3个部分。以P≤0.05为条件，可分别得到BP富集条目732条，CC富集条目9条，MF富集条目42条，结果按P值由小到大排序作图，作图限定为最多显示20个条目，图中横坐标表示基因的数目，颜色代表P值大小，从深红到深蓝表示P值逐渐变大。见图4～6。通过GO功能富集分析，逍遥散治疗痤疮所涉及的生物学过程主要包括：脂多糖应答（Response to Lipopolysaccharide），细菌源性分子應答（Response to Molecule of Bacterial Origin），药物的细胞应答（Cellular Response to Drug）等。涉及的细胞组分主要是：细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合体（Cyclin-dependent Protein Kinase Holoenzyme Complex）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物（Serine/Threonine Protein Kinase Complex）、膜筏（Membrane Raft）、膜微区（Membrane Microdomain）、膜区（Membrane Region）等。涉及的分子功能主要有：细胞因子受体结合（Cytokine Receptor Binding）、细胞周期蛋白依赖的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节活性（Cyclin-dependent Protein Serine/Threonine Kinase Regulator Activity）、组蛋白激酶活性（Histone Kinase Activity）、细胞因子活性（Cytokine Activity）等。

2.7 KEGG通路富集分析利用R语言软件，将逍遥散及痤疮共同靶点进行KEGG通路富集分析，可得到76条信号作用通路，并选择基因富集程度最高的前20条作用通路绘制气泡图。见图7。图中气泡的大小表示通路上富集的基因数，气泡的颜色差异代表基因在该条通路上富集程度。通过KEGG通路富集分析可以发现逍遥散治疗痤疮的作用通路主要为：肿瘤坏死因子信号通路（TNF Signaling Pathway）、IL-17通路（IL-17 Signaling Pathway）、核因子κB通路（NF-κB Signaling Pathway）、P53信号通路（P53 Signaling Pathway）。

使用Cytoscape软件，以此基因富集数目最多的20个KEGG通路及其富集的基因做KEGG关系网络可视化处理，外圈为KEGG通路名称代号，内圈为基因简称，体积差异代表其连接节点的数目，体积越大则连接节点越多。在各KEGG通路上富集较多的基因为IL6、IL1B、ICAM1、CASP3等。见图8。

3 讨论

痤疮，属于中医所认识的肺风粉刺的范畴，常规认为是肺经风热所致，但由于现代生活习惯和工作压力等因素，肝气郁结亦是其常见病因[5]。肝气郁结，气郁化火，加之现代人饮食结构改变，多贪食辛辣、肥甘之品，易内生痰湿，湿热相互交加上冲头目，发于面鼻而成粉刺[6]。痤疮患者常因痤疮发于面部，影响美观而产生自卑、情绪抑郁、急躁等情志问题，这类问题又可能致思虑过多，肝郁而不疏，气机阻滞，不能透达到外部，郁而成痤疮，易形成“痤疮形成-情绪抑郁-痤疮形成”的恶性循环，故痤疮可考虑从肝论治[7]。有报道显示，以疏肝解郁，健脾养血之法，使用逍遥散加减内服对于青少年痤疮的治疗有明显的疗效[8]。逍遥散中柴胡、薄荷共奏疏肝理气解郁之效而助“肝用”，当归、白芍有养血柔肝之用而补“肝体”，白术、茯苓则共有健脾益气、化湿祛痰之功，使中焦脾土运化有权、气血化生有源，炙甘草调和诸药兼能益气补中，缓肝之急，各药效结合方能调和肝脾、疏肝解郁、养血健脾[9-10]。目前，逍遥散治疗痤疮具体的药理作用机制仍不清楚。中药复方治疗疾病时具有多有效成分、多靶点、多作用通路的特点，结合网络药理学大数据分析的特点，使用网络药理学方法研究逍遥散治疗痤疮的作用机制通路较为适合[11]。本研究意在探究相关分子作用机制，为临床上从肝论治痤疮提供证据支持，可扩大逍遥散在临床上的应用范围，并为后续的研究提供理论基础。

本研究通过TSMSP得到逍遥散中有效活性成分共161种，与既往相关研究相符[12]。结合化合物作用靶点及痤疮相关靶基因信息，建立“化合物-靶点”的中药复方调控网络模型，确定对痤疮治疗最可能的潜在有效成分以黄酮类为主，包括木犀草素、槲皮素、异鼠李素等。研究表明黄酮类化合物具有抑菌作用，并且具有广泛的抑菌作用，多种对抗生素有耐药性的细菌仍然对其敏感，并且黄酮类化合物临床使用时不容易产生耐药性[13-14]。木犀草素属于黄酮类化合物，已被实验证明具有抗炎作用，其作用机制可能通过降低iNOS蛋白的表达，进而减少炎症介质NO的产生[15]。木犀草素还可以显著抑制COX-2蛋白的高表达，显示出抗炎作用[16]。槲皮素可以有效抑制大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的生长，同时其作为蛋白激酶的抑制剂和信号分子，能抑制炎症介质释放，具有抗感染、抗炎等作用，对炎症性皮肤病的治疗有良好的效果[17-18]。逍遥散的有效成分中与作用靶点连接较多的化合物还包括：三萜皂苷、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、芦荟大黄素、甘草查尔酮A、刺槐素、柚皮苷等，提示其可能为痤疮治疗的有效成分，为今后相关药理学研究和新药物的开发提供理论支持。

本研究在收集逍遥散和痤疮相关靶点的基础上，对逍遥散和痤疮的共同靶点进行PPI网络绘制分析，对所得网络进行拓扑分析，进而得到其药物活性成分-疾病-靶PPI核心网络，核心蛋白为NMP1、YWHAZ、HSPA8、UBC、HSP90AA1、CDK2、VCP等。

GO功能富集结果显示逍遥散治疗痤疮的作用机制多集中于脂多糖应答、细菌源性分子应答、药物的细胞应答等。作用部位多在细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、细胞膜筏、膜微区、膜区等。所涉及的分子功能主要有：细胞因子受体结合、细胞周期蛋白依赖的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节活性、组蛋白激酶活性、细胞因子活性等。KEGG通路富集结果显示逍遥散治疗痤疮的生物靶标主要与肿瘤坏死因子、IL-17、P53信号、核因子κB信号通路有关。研究表明，痤疮的炎症反应的机制可能是痤疮丙酸杆菌细胞壁上的肽聚糖分子被外周血中单核细胞TLR2识别后诱导单核细胞，经由胞内信号传导通路作用，激活核因子κB啟动细胞核内的相关基因表达，促进IL-8、TNF-α等炎症介质的生成，炎症介质被释放到细胞外，引起炎症反应[19-20]。本研究中KEGG分析结果提示基因多富集于肿瘤坏死因子通路及核因子κB信号通路，与痤疮的炎症反应机制相符，可能为逍遥散治疗痤疮的主要作用通路。

本研究基于网络药理学的方法，从分子水平初步探讨了逍遥散治疗痤疮的主要活性成分、对应基因靶点、对应蛋白质靶点及作用生物通路，简单阐述了逍遥散用于治疗痤疮的作用机制，为后续实验提供理论基础，也为中药复方作用机制研究和痤疮治疗的新药物研发提供了方法和思路。

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