经方甘草干姜汤成分的快速分析及其治疗呼吸系统疾病的作用

牛 璐李伟霞 张 辉王晓艳张明亮陈毓龙唐进法

（1.河南中医药大学，河南 郑州450046； 2.河南中医药大学第一附属医院中药临床评价技术河南省工程实验室，河南 郑州450000； 3.河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州450046）

甘草干姜汤是《金匮要略》 中记载的一首经方，由炙甘草（12 g）和炮姜（6 g）两味中药组成，主治肺痿咳吐涎沫［1］。《金匮要略讲义·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》第五条言，“肺痿吐涎沫而不咳者，其人不渴，必遗尿，小便数，所以然者，以上虚不能制下故也。此为肺中冷，必眩，多涎唾，甘草干姜汤以温之”［2］。方中炙甘草和炮姜配伍，干姜辛温能走能受，温中回阳，温肺化痰，偏治里寒，炮焦，有温经止血功效；配炙甘草，补脾益气，祛痰止咳，缓急止痛，辛从甘化，能受中复阳。两药合用，一补脾胃之虚，一复中焦之阳，使中阳得运，统摄有权，则吐血可止［3］。共同起到益气、温阳、化痰、止血的功效［4］。该方药简力宏，今人多认为此方有“培土生金”之妙，是现代临床治疗肺痿、哮喘、眩晕、尿频等病证常用的基本方［5］。但目前有关甘草干姜汤的研究多集中在临床观察方面，而物质基础和作用机制的研究报道较少［6⁃9］。故本研究拟采用超高液相色谱⁃四级杆⁃飞行时间质谱（ultra⁃performance liquid chromatography⁃quadrupole⁃time of flight⁃mass spectrometry，UPLC⁃Q⁃TOF／MS）技术结合UNIFI 数据库对甘草干姜汤中化学成分进行快速分析，基于此，进一步采用网络药理学方法和分子对接技术对甘草干姜汤治疗呼吸系统相关疾病（肺纤维化、间质性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘）的作用机制进行探讨，以期为甘草干姜汤的质量控制、体内过程分析及作用机制的深入研究奠定基础，也为甘草干姜汤在临床的合理应用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters AcquityTMUPLC 液相系统；Xevo G2⁃XS QTof 质谱仪，配有 Lock⁃spray 接口，电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），MassLynx v4.1 质谱工作站；ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；XS105DU型十万分之一天平（瑞士梅特勒⁃托利多集团）；Neofuge 1600R型台式低温高速离心机（上海力申科学仪器有限公司）；KQ⁃100DE型数显超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药物与试剂 乙腈（批号JB086630）和甲醇（批号10999607909）为色谱纯试剂，购自德国Merck 公司；甲酸（批号3257145）色谱纯试剂，购自北京迪马科技有限公司；亮氨酸脑啡肽（批号W15071909）购自美国Waters 公司；其他试剂均为分析纯。炙甘草（批号19120101）购自郑州瑞龙制药股份有限公司，炮姜（批号190901）购自安徽石田中药饮片有限公司；经河南中医药大学第一附属医院药学部陈天朝主任药师鉴定，均符合2015年版《中国药典》（一部）炙甘草、炮姜项下标准［10］。

对照品10⁃姜酚（批号CHB180311）、橙皮苷（批号CHB180523）、甘草酸（批号CHB180610）、络石苷元（批号CHB190106）、蒙花苷（批号CHB180120）、野黄芩苷（批号CHB180629）、木犀草苷（批号CHB180111）购自成都克洛玛生物科技有限公司；补骨脂定（批号16042601）、补骨脂二氢黄酮甲醚（批号16060103）、补骨脂宁（批号160422）、川续断皂苷乙（批号150922）、大豆苷（批号17040603）、大豆苷元（批号17122504）、大黄素甲醚（批号141214）、槲皮苷（批号151016）购自成都普菲德生物技术有限公司；丹酚酸B（批号P10A8F41491）、冬凌草乙素（批号Z13A7S13006）、地肤子皂 苷 IC（批号P15M6F2）、丹参酮Ⅰ（批号P20J8F40359）购自上海源叶生物科技有限公司；甘草次酸（批号lw19090603）、甘草素（批号lw19052203）和芒柄花素（批号lw18022712）购自南京良纬生物科技有限公司；甘草苷（批号PRF8110742）购自成都普瑞法科技开发有限公司；特女贞苷（批号111926⁃201404）购自中国食品药品检定研究院，以上所有对照品纯度均≥98.0%。

2 方法

2.1 供试品溶液制备 将炙甘草、炮姜饮片打粉，过80 目筛，精确称取炙甘草粉末1.030 2 g、炮干姜粉末0.499 0 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，加入30 mL 50%甲醇，超声提取1 h（功率100 W，频率40 kHz），静置后吸取上清液1 mL，于离心机14 000 r／min 离心10 min，吸取上清液100 μL待分析。

2.2 对照品溶液制备分别精密称定对照品10⁃姜酚、橙皮苷、甘草酸、络石苷元、蒙花苷、野黄芩苷、木犀草苷、补骨脂定、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂宁、川续断皂苷乙、大豆苷、大豆苷元、大黄素甲醚、槲皮苷、丹酚酸B、冬凌草乙素、地肤子皂苷IC、丹参酮Ⅰ、甘草次酸、甘草素、芒柄花素、甘草苷和特女贞苷，加甲醇分别制备成质量浓度分别为520、420、640、380、208、332、304、298、284、306、420、338、420、360、260、220、204、300、282、420、340、272、296、220 μg／mL 的对照品贮备液。

2.3 数据采集与处理

2.3.1 色谱条件 流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱（0～1 min，20% B；1～24 min，20%～80% B；24～25 min，80%～100% B；25～27 min，100% B；27～27.5 min，10%～100% B；27.5～30 min，10% B）；柱温40 ℃；体积流量0.3 mL／min；进样量2 μL。

2.3.2 质谱条件 ESI 源，以MSEContinuum 模式在负离子条件下进行数据采集。毛细管电压2.5 kV；离子源温度100 ℃；脱溶剂气温度250 ℃；锥孔电压40 V；锥孔气体积流量50 L／h；脱溶剂体积流量600 L／h；碰撞能量（10～45 V）；间隔扫描时间0.1 s。质量扫描范围50～1 200m／z。准确质量测定采用亮氨酸⁃脑啡肽（1eucine⁃enkephalin，ESI－m／z554.261 5）溶液为锁定质量溶液，采用甲酸钠溶液对仪器质量轴进行校正。

2.3.3 成分分析 查阅在线和离线数据库（PubMed、TCMSP、Chemical book、Chemspider、化学专业数据库等）及相关文献，收集甘草干姜汤中单味药的化学成分信息，主要包括化合物英文名称、分子式、结构式，自建甘草干姜汤成分数据库（EXCEL），导入UNIFI 数据库。将采集的甘草干姜汤质谱数据导入UNIFI 软件中，建立过滤筛选方法，设置质量误差为5×10－6，保留时间误差为0.1 min，响应值＞5 000，将甘草干姜汤的质谱数据与所建数据库进行自动匹配，结合对照品保留时间及文献信息进一步进行确认，并进行成分归属。

2.4 甘草干姜汤中活性成分及呼吸系统疾病靶点的收集和匹配 首先基于成分分析结果，通过中药系统药理学数据库与分析平 台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug⁃likeness，DL）≥0.18，对甘草干姜汤中活性化合物进行筛选；然后通过TCMSP 及Swiss Target Prediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch）数据库对甘草干姜汤中活性成分靶点进行预测。

在疾病关联数据库（genetic association database，GAD）、治疗靶标数据库（Therapeutic Target Database，TTD）（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／ttd，TTD）和基因名片数据库（Gene Cards） （http：／ ／www.genecards.org／）等对呼吸系统疾病肺纤维化（Pulmonary fibrosis）、间质性肺疾病（Interstitial lung disease）、慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease）、哮喘（Asthma）的靶点进行预测。

所有靶点通过Uniprot 蛋白质数据库（http：／ ／www.Unitprot.org／）将蛋白名转换成基因名后，采用维恩图对甘草干姜汤活性成分靶点及疾病靶点进行匹配，得到成分⁃疾病共有靶点。

2.5 京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代谢通路富集和基因本体论（Gene_ Ontology，GO）生物功能分析 将甘草干姜汤活性成分与疾病共有靶标输入生物学信息注释数据库（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）生物学信息注释数据库（https：／ ／david.ncifcrf.gov／ conversion.jsp），进行KEGG 通路分析和GO 富集分析。KEGG 通路筛选以p⁃value＜0.05 为限制条件。GO 富集分析，包括生物过程（BP，Biological Process）、分子过程（MF，Molecular Function）和细胞组成（CC，Cellular Component）3个部分，以p⁃value＜0.05 为限制条件。结合基迪 奥云平台（Omicshare 数据库）（http：／ ／www.omicshare.com／ tools／index.php／）将筛选条目制作成高级气泡图。

2.6 成分⁃靶点⁃疾病网络构建 采用生物信息分析软件Cytoscape 3.6.1 构建甘草干姜汤的“成分⁃靶点⁃疾病”网络。网络图中的节点（node）表示活性成分、靶基因、疾病和通路，节点间相互关系用边（edge）表示，利用软件网络分析（Network Analyzer）功能进行网络拓扑分析。

2.7 分子对接验证甘草干姜汤活性成分与作用靶点相互作用 将“2.6”筛选得到的核心成分作为小分子配体库，在TCMSP 数据库下载各活性成分结构mol2 格式；在蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）（http：／ ／www.rcsb.org／）下载重要潜在靶点蛋白质的晶体结构pdb 格式，作为受体库。采用SYBYL⁃X 1.3 软件对小分子化合物及受体进行优化，并利用对接套件（Docking suite）选项进行分子对接；将对接后的蛋白导入Pymol 3.8 软件进行渲染作图。同时，通过药物数据库（Drugbank）（https：／ ／www.drugbank.ca／）查找作用于潜在靶点的临床药物进行对接作为对照。

3 结果

3.1 基于UPLC⁃Q⁃TOF／MS 的化学成分鉴别 甘草干姜汤的基峰离子流图（BPI）见图1。在甘草干姜汤供试品溶液中共检测到116个化合物（见表1），其中95个归属于炙甘草，19个归属于炮姜，2个为炙甘草、炮姜共有成分。所测成分主要包括黄酮类、生物碱类、皂苷类等，其中24个化合物经与对照品确认。以新甘草苷（化合物28）为例，准分子离子峰为［M⁃H］－m／z417.119 2，化合物28 脱去一个C6H10O5中性片段得到M1［M⁃H⁃162］－m／z255.066 3 的碎片离子，M1 进一步脱去C8H8O 中性片段得到M2［M⁃H⁃120］－m／z135.008 4 的碎片离子，准分子离子脱 去C13H14O8中性片段得到M3［M⁃H⁃298］－m／z119.049 9 的碎片离子，可推断该化合物为新甘草苷，该化合物在负离子模式下的高能裂解质谱图和裂解途径见图2。

表1 甘草干姜汤化学成分鉴定结果

续表1

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图1 甘草干姜汤的基峰离子流图

图2 新甘草苷的质谱图和裂解途径

3.2 甘草干姜汤成分靶点与疾病靶点分析 检测得到的甘草干姜汤116种成分中，40个成分满足OB≥30%和DL≥0.18，12种成分通过文献检索确认具有较强的药理活性［11⁃18］，共得到甘草干姜汤候选成分52种。通过TCMSP和Swiss Target Prediction 数据库得到甘草干姜汤成分对应的靶点837个。通过GAD、TTD、Gene Cards 等数据库检索得到肺纤维化相关靶标37个、间质性肺疾病相关靶标12个、慢性阻塞性肺疾病相关靶标444个，哮喘相关靶标714个。经与成分靶标匹配后得到共有靶点211个。

3.3 KEGG 代谢通路富集和GO 生物功能过程分析 将甘草干姜汤成分与呼吸系统疾病共有的211个靶点输入DAVID 数据库，得到KEGG 通路83 条（P＜0.05），筛选与疾病相关排名前20 的通路条目见图3A。GO 富集分析得到BP、CC、MF 各405、52、108 条，排名前20 的条目分别见图3B～3D。通过富集分析可知，甘草干姜汤治疗呼吸系统疾病的靶点主要富集与神经活性配体⁃受体相互作用、钙离子信号通路、乙型肝炎、PI3K⁃Akt 信号通路等；生物过程主要涉及药物反应、胞质钙离子浓度正调节、炎症反应、凋亡过程负调控、对抗生素的反应等；这些靶点在细胞组分中与质膜、胞质、细胞器膜等较为相关；在分子功能中与药物结合、血红素结合、蛋白质酪氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶结合等高度相关。

图3 甘草干姜汤KEGG 通路（A）、BP（B）、CC（C）、MF（D） 富集分析

3.4 甘草干姜汤成分⁃疾病⁃靶点网络构建结果 采用Cytoscape 3.6.1 软件构建甘草干姜汤“成分⁃靶点⁃疾病”网络（图4）。为寻找成分⁃靶点⁃疾病网络中具有重要作用的靶标，进一步对导出拓扑数据excel 文件分析，设置度值＞14 进行核心网络筛选（图5）。由图5 可知，筛选得到鳞叶甘草素A（MOL004828）、毛蕊异黄酮（MOL000417）、异甘草黄酮醇（MOL004949）、红车轴草素（MOL003398）等核心成分共40种，PPARG、ESR2、PTGS2 等核心靶标36个。

图4 甘草干姜汤的成分⁃疾病⁃靶点网络

图5 甘草干姜汤的成分⁃疾病⁃靶点核心网络

3.5 分子对接验证结果 通过甘草干姜汤核心成分⁃疾病⁃靶点网络，将度值前4 的靶点ESR1（PDB ID：5GS4）、ESR2（PDB ID：5AAU）、PPARG（PDB ID：5U41）、PTGS2（PDB ID：4OTY）分别与40种核心成分进行分子对接。其中，Total Score 表示配体分子与蛋白质活性位点的结合作用分数，分值越高，配体分子与蛋白质的结合作用越好；Crash 为碰撞分数，值越高表示配体与蛋白质活性位点空腔形成的能量匹配情况越好；Polar值表示配体分子与活性位点氨基酸残基间的氢键键合能力，分数越高，键能越强［19］。40种核心成分与4个靶点的主要对接结果（Total Score ≥5）见 表 2。结果显示，6⁃姜辣素（MOL002467）、甘草黄酮C（MM0002）等12种成分与ESR1 有较强相互作用；刺果甘草查尔酮（MOL004835）、甘草皂苷A3（MM0005）等21种成分与ESR2 存在较强的相互作用；10⁃姜辣素（MOL002459）、甘草黄酮 C（MM0002）等37种成分与PPARG 存在较强的相互作用；6⁃姜辣素（MOL002467）、异甘草黄酮醇（MOL004949）等24种成分与PTGS2 有较强相互作用。其中，与ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2 对接结果最强的化合物分别为甘草黄酮C（MM0002）、6⁃姜辣素（MOL002467）、10⁃姜辣素（MOL002459）和6⁃姜辣素。通过DrugBank 和文献等查阅得到作用于ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2 的临床常用药分别为己烯雌酚、雷洛昔芬、孟鲁斯特和奥沙普嗪。甘草黄酮C（MM0002）、6⁃姜辣素（MOL002467）、10⁃姜辣素（MOL002459）和6⁃姜辣素及临床常用药己烯雌酚、雷洛昔芬、孟鲁斯特和奥沙普嗪与ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2的对接结果见表3 和图6。结果显示，甘草干姜汤中成分与ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2 靶标的对接结果不弱于现有临床常用药物的结合作用。

图6 ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2分子对接模型

表2 甘草干姜汤活性成分与靶点分子对接结果

表3 ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2分子对接结果

4 讨论

通过比较甘草干姜汤正离子和负离子2种检测模式，发现负离子模式下峰容量和响应强度均优于正离子模式［20］，故本研究仅采用负离子模式进行分析，共鉴定得到116个化合物，包括黄酮类、生物碱类、皂苷类等多种成分。进一步通过网络药理学方法构建甘草干姜汤“核心成分⁃靶标⁃疾病”网络，根据degree值筛选得到柚皮素、甘草素、6⁃姜辣素、光甘草宁、毛蕊异黄酮、姜酮等40种关键成分，ESR2、PPARG、PTGS2、ESR1 等36个核心靶标，癌症通路（Pathways in cancer）、PI3K⁃Akt 信号通路、神经活性配体⁃受体相互作用（Neuroactive ligand⁃receptor interaction）、乙型肝炎（Hepatitis B）等83 条信号通路。分子对接验证结果显示，甘草黄酮C（MM0002）、甘草皂苷A3（MM0005）、短叶松素（MM0006）、10⁃姜辣素（MOL002459）、6⁃姜辣素（MOL002467）、姜 酮（MOL002516）、异甘草黄酮醇（MOL004949）与核心靶点ESR2、PPARG、PTGS2、ESR1 均具有较强相互作用，显示了甘草干姜汤多成分⁃多靶点的特点。分子对接验证选择度值较高靶标分别与甘草干姜汤中核心成分及能够作用于关键靶标的临床常用药物分别进行分子对接进行比较，结果显示，甘草干姜汤中活性成分（甘草黄酮C、6⁃姜辣素、10⁃姜辣素和6⁃姜辣素）与ESR1、ESR2、PPARG 和PTGS2的结合能力均强于临床药物己烯雌酚、雷洛昔芬、孟鲁斯特和奥沙普嗪，提示网络药理学预测结果的可靠性。

ESR1 和ESR2 是雌激素受体，雌激素受体在大鼠、小鼠以及人的肺组织中均有表达，且参与肺泡分化及保证肺正常弹性收缩［21］，此外有研究表明雌激素受体可加重脓毒症大鼠的炎症反应，对肺组织造成破坏［22］。PPARG 是肺成纤维细胞活化的重要调节因子，在控制细胞分化中有较强作用，可调节炎症和纤维化反应［23］。在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）发病过程中，PPARG 表达下调减弱了其抗炎、抗氧化作用，激活了氧化应激反应活性并引起气道炎症［24］。而PTGS2 活性的增加则会引起支气管黏膜水肿，增加气道炎症，从而加重患者的气流阻塞［25］。

李晓红等［26］研究发现，甘草皂苷类可通过抑制环氧合酶⁃2 的表达而降低前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）合成，从而具有显著的抗炎作用。有实验表明异甘草黄酮醇能够显著诱导Nrf2 及其反向基因GR、GPX和NQO1，从而具有对百草枯引起的急性肺损伤的抗氧化和解毒作用，减轻肺水肿和纤维化［27］。6⁃姜辣素（MOL002467）的体外实验显示，该成分能够抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）诱导的人内皮细胞增殖，并导致G1 期细胞周期停滞，并且阻断血管内皮细胞对VEGF 的反应形成毛细血管样管，强烈抑制大鼠主动脉内皮细胞的萌发和小鼠角膜对VEGF 的反应形成新血管，表明6⁃姜辣素能够抑制血管生成，可能在肿瘤和其他血管生成依赖性疾病的治疗中起作用［28］。在氨基甲酸诱导的肺癌模型中，6⁃姜辣素也可以作为精氨酸酶抑制剂，对支持肿瘤 的巨噬细 胞有重编程作用［29］。姜 酮（MOL002516）具有抗氧化和抗炎作用，有研究表明，姜酮在体内外均能显著抑制LPS 诱导的促炎细胞因子的产生，阻断ERK、p38／MAPK 和IκBα、NF⁃κB／P65 的磷酸化，减弱丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子kappa B（NF⁃κB）信号通路，这些结果提示姜酮对LPS 诱导的急性肺损伤具有保护作用［30］。

PI3K⁃Akt 通路是肺纤维化过程中一个重要的信号调控系统，主要参与细胞的生长、分化、凋亡及血管生成，能通过调控下游中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、缺氧诱导因子⁃1α（hypoxia inducible factor⁃1，HIF⁃1α）及活性氧类（Reactive oxygen species，ROS）系 统等参与肺纤维化［31］，且与NF⁃κB 信号通路、MAPK 信号通路等关系密切。神经活性配体⁃受体相互作用通路信号的改变可能引发肺部癌症、炎症性疾病［32］。呼吸系统疾病患者常伴随有肝损害，如小儿支原体感染性肺炎常合并肝损伤［33］，甘草干姜汤对乙型肝炎通路的作用可能对肝损伤的治疗起到一定的治疗效果。

综上，本实验采用UPLC⁃Q⁃TOF／MS 技术，快速、准确地从整体系统阐释甘草干姜汤中的化学成分，从中鉴定得到116个化合物，以期为其质量标志物的筛选奠定前期基础。进一步结合分子对接技术对甘草干姜汤治疗呼吸系统疾病的化学成分、作用靶点、代谢通路方面进行研究，初步探讨了甘草干姜汤治疗呼吸系统疾病的作用机制，为今后对甘草干姜汤进一步开发提供理论和实验依据。