基于生物信息学分析MCM8基因在胃癌组织中的表达及临床意义①

赵锛活 苗 蓓 费素娟 （徐州医科大学附属医院消化病研究中心，徐州 221000）

胃癌是全球第五大最常见的恶性肿瘤，也是第四大最常见的癌症死亡原因［1］。在亚洲，日本、韩国及我国是胃癌高发区，我国每年新发病例约40 万例，占世界总发病例数的42%。目前，胃癌早期治疗的主要手段是手术治疗，但多数胃癌患者就诊时已处于进展期，失去了最佳手术时机。由于进展期胃癌的早期临床症状缺乏典型性且预后差，因此，探究细胞内分子表达异常、细胞信号通路以及肿瘤微环境变化在胃癌发生发展中的作用，对胃癌的早期诊断、预后评估及寻找治疗靶点显得尤为重要。

微小染色体维持蛋白（minichromosome mainte‑nance proteins，MCMs）家族最初是在酿酒酵母基因筛选中发现的，是一种广泛存在于高等真核生物中并且高度保守的蛋白质，在DNA 复制起始、延伸、转录、染色体重构和基因组稳定中起重要作用，并且在多种人类癌前病变及癌症中异常表达，成为恶性肿瘤生物学标志物［2］。目前发现的MCM家族成员共有10 个，包括 MCM1～10。除 MCM1 和 MCM10 外，MCM2-9 蛋白在结构上均存在一个约200 多个氨基酸长度的核心区域，称为 MCM 盒（MCM box）［3］。有学者认为MCM1 和MCM10 不属于MCM 蛋白家族［4-5］。MCM2～7 通常形成六聚体复合物发挥生物学功能，这是启动DNA合成的起始步骤［6-8］。近年来有不少研究指出，MCM2、4、5、7在胃癌组织中的表达水平均较正常胃黏膜组织显著升高，且与胃癌的发生发展过程有关［9-14］。MCM8 是 MCM 蛋白家族的重要成员，是在研究携带乙型肝炎病毒的肝癌患者定向基因时发现的［15］。近年来研究发现MCM8在多种人类癌症，包括乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、成髓细胞瘤和多形胶质母细胞瘤中过表达，表明MCM8 过表达在人类恶性肿瘤中具有广泛的意义［16］。然而，目前国内外关于MCM8在胃癌中的表达及其意义的研究较少，因此本研究基于生物信息学分析该基因在胃癌及癌旁组织中表达差异，通过免疫组化染色进一步验证其蛋白水平的差异表达，并进一步预测其对胃癌的诊断、治疗及预后的价值。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 Oncomine 数据库分析MCM8 在人类常见类型肿瘤中的表达概况 Oncomine 数据库（https：/ /www.oncomine.org）是一个在线的、可公开访问的癌症微阵列数据库，其已经收集了715 个数据集的86 733 个样本的基因表达数据，整合了GEO、TCGA和已发表文献等来源的RNA 和DNA-seq 数据，旨在促进基于全基因组表达分析的潜在靶基因的识别［17-18］。数据分析时，搜索MCM8 基因，analysis type设 置 为“Cancer vs Normal analysis”，以 log Fold Change≥2.0，P值<0.05作为筛选标准，Gene Rank设置为“Top 10%”，Data type 设置为“mRNA”，调取MCM8基因在人类常见类型肿瘤中的表达概况。

1.1.2 GEO、TCGA 数据库分析 MCM8 在胃癌中的表达情况 在GEO 数据库（https：/ /www.ncbi.nlm.nih. gov/geo/）中搜索“gastric cancer”关键词，获取GSE27342 数据集中160 例胃癌组织和癌旁组织的基因表达谱，通过GEO2R 在线分析并提取MCM8基因表达量（探针编号为3875195），使用Graphpad Prism 8.2 软件进一步统计分析；利用ULCAN（http：/ /ualcan. path. uab. edu/）工具分析 TCGA 数据库中收集的415 例胃癌肿瘤组织和34 例癌旁组织中MCM8基因的表达水平，并进一步分析其与Tu‑mor grade、Tumor stage的关联。

1.1.3 实验试剂 MCM8 兔抗人单克隆抗体购自美国Thermofisher公司，超敏二步法免疫组化检测试剂、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 胃癌组织样本收集 收集2018 年1 月至2019年12月徐州医科大学附属医院普外科手术切除的胃癌组织标本30例，并收集对应的癌旁组织（距离肿瘤边缘>5 cm）作为对照。所有患者均为初诊患者，术前未行放、化疗及生物免疫治疗，所有胃癌标本均经本院病理证实。本研究经徐州医科大学伦理委员会批准，伦理审查意见号为XYFY2020-KL170-01。

1.2.2 免疫组织化学染色 按超敏二步法免疫组化检测系统进行，DAB 显色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，正置显微镜拍照。胞核内有棕色颗粒者为阳性细胞，运用Image Pro Plus 6.0 软件分别对30 例胃癌和癌旁组织中MCM8 阳性染色的积分光密度值（integrated optical density，IOD）进行分析，使用GraphPad Prism8.2统计作图。

1.2.3 Kaplan-Meier Plotter数据库分析生存率 运用 Kaplan-Meier 数据库（http：/ /kmplot. com/analy‑sis/）分析胃癌基因芯片数据，筛选MCM8基因，根据胃癌组织中MCM8 基因表达水平的中位数进行高、低表达MCM8 基因分组，采用自动选择截断值（auto select best cutoff）分析MCM8表达高低对胃癌患者的总体生存率（overall survival，OS）的影响，并分别对HER2阴性、阳性的胃癌患者进行总体生存率及进展后生存率（post progression survival，PPS）进行分析。

1.2.4 TISIDB 数据库分析MCM8 基因表达与胃癌肿瘤免疫浸润水平的相关性 TISIDB（http：/ /cis.hku.hk/TISIDB/index.php）是肿瘤与免疫系统交互的门户网站，其集成了包括PubMed 文献挖掘结果、高通量测序筛选结果、TCGA、Uniprot 数据库的多种数据类型。分析数据时搜索MCM8 基因，选择“lym‑phocyte”，cancer type 选 择“stomach adenocarcino‑ma”，item 分别选择“Activated CD4+T cell”、“Activat‑ed CD8+T cell”、“Activated B cell”、“Natural killer cell”、“dendritic cell”，以探讨 MCM8 表达与胃癌肿瘤免疫浸润水平间的相关性。

1.2.5 cBio-Portal 数据库分析MCM8 基因的共表达网络 分析cBio-Portal 数据库（www. cbioportal.org）中的胃癌患者数据，分析时选择Stomach Adeno‑carcinoma（TCGA，Firehose Legacy），分析其mRNA表达（RNASeqV2 RSEM 分析），提取MCM8 的共表达（Co-expression）基因。随后将MCM8 的共表达基因输入David 数据库（https：/ /david. ncifcrf. gov/），对其进行生物学进程（Biological Progress）、细胞组分（celluar component）、分子功能（Molecular Func‑tion）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge‑nomes）pathway 分析，以探讨 MCM8 在胃癌中的细胞定位及其参与的生物学过程和信号调节网络。

1.2.6 STRING、GEPIA 数据库分析 MCM8 的蛋白相互作用网络及其相关性 基于cBio-Portal 筛选到的 MCM8 相关基因，结合 STRING 数据库（https：/ /string-db.org/）分析MCM8 的蛋白-蛋白相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI network），并通过GEPIA 数据库（http：/ /gepia.cancer-ku.cn/）进一步验证该网络中的蛋白与MCM8间的相关性。

1.3 统计学处理 Oncomine 数据库的研究结果中红色越深表示MCM8 在该芯片中表达越高，蓝色越深表示MCM8 在该芯片中表达越低。GSE27342 数据集获取的胃癌及其相对应的癌旁组织中MCM8基因表达水平的比较采用配对t检验。临床标本免疫组化阳性染色的IOD 的比较采用t检验。采用Ka‑plan-Meier 生存曲线和 Log-rank 检验分析 MCM8 基因表达量与胃癌患者预后的关系。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCM8 基因在人类常见类型的肿瘤中过度表达 Oncomine 数据库分析MCM8 基因在人类常见类型肿瘤和正常组织中的表达差异结果显示：MCM8 基因在人胃癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、头颈部和中枢神经系统肿瘤中过度表达（图1）。

图1 MCM8在人类多数肿瘤中高表达Fig.1 MCM8 was overexpressed in most human tumors

2.2 MCM8 基因在胃癌组织中过表达 GEO、TC‑GA 数据库分析结果显示：MCM8基因在胃癌组织中的表达量较癌旁组织高，差异均具有统计学意义（图2A、B）；分析MCM8基因表达水平与胃癌患者临床病理学参数间的关系后发现：与中、高分化癌相比，低分化癌患者组织中的MCM8 基因表达水平更低（图2C），差异有统计学意义；MCM8 基因表达水平与胃癌肿瘤分期无显著相关性（图2D）。

图2 MCM8在胃癌组织中高表达Fig.2 MCM8 was overexpressed in gastric cancer tissues

2.3 免疫组化染色结果示MCM8 蛋白在胃癌中过表达 30例胃癌和癌旁样本免疫组化染色结果如图3A、B 所示。MCM8 蛋白的阳性表达主要位于胞核内，部分胞浆内亦有表达，呈棕黄色颗粒样。在相同的判定标准下，胃癌组织中MCM8 阳性染色部分的IOD 值显著高于癌旁组织，差异有统计学意义，表明MCM8蛋白在胃癌组织中过表达（图3C）。

图3 胃癌和癌旁组织中MCM8的表达情况（免疫组织化学染色，×400）Fig.3 Expression of MCM8 protein in gastric cancer and adjacent normaltissues（immunohistochemical staining，×400）

2.4 MCM8基因表达与胃癌患者的预后密切相关 通过Kaplan-Meier 数据库分析胃癌患者MCM8 基因表达水平与预后的关系后发现：MCM8高表达组胃癌患者的OS 显著低于低表达组，差异有统计学意义（图4A）；根据HER2把胃癌患者分为HER2阴性组和HER2阳性组，分析发现两组中MCM8高表达的胃癌患者OS 及PPS 均显著低于MCM8 低表达者，且在HER2 阴性组中差异有统计学意义（图4B、C），而在HER2阳性组中差异无统计学意义（图4D、E）。

图4 MCM8表达与胃癌患者预后密切相关Fig.4 MCM8 expression was closely associated with prog⁃nosis of gastric cancer patients

2.5 MCM8 基因表达水平与胃癌肿瘤免疫浸润水平密切相关 TISIDB 数据库分析结果显示：MCM8基因表达水平与胃癌肿瘤浸润NK 细胞、B 细胞、DC细胞的表达丰度均呈负相关，与CD4+T 细胞的表达量呈正相关，差异有统计学意义（图5A~D）；而MCM8 基因达水平与CD8+T 细胞表达丰度亦呈负相关，差异无统计学意义（图5E）。

图5 MCM8与胃癌肿瘤免疫浸润水平的相关性Fig.5 Correlation of MCM8 expression with immune in⁃filtration level in gastric cancer

2.6 MCM8 共表达基因的富集分析 按照前述方法从cBio-Portal数据库中筛选到415例胃癌标本，其中与MCM8 共表达的基因有20 225 个，以spearman相关系数绝对值>0.3 作为筛选标准，获得2 153 个基因并对其进行gene ontology（GO）富集分析及KEGG-pathway 分析。结果表明：MCM8 主要定位于细胞核内，其参与的生物学进程包括细胞分化、DNA 复制和修复、核分裂、染色单体黏附和分离、细胞有丝分裂G1/S 和G2/M 期过渡、蛋白质磺酰化、mRNA 和 tRNA 从胞核向胞质的转运等；MCM8 的分子功能包括与蛋白质、ATP、DNA、RNA、染色质、核苷酸的结合，调控单链DNA 依赖性ATP 酶活性，与DNA 复制起点结合等（图6）。KEGG-pathway 分析结果显示MCM8 可能参与细胞周期、RNA 转运及降解、嘌呤和嘧啶代谢、mRNA监视、核糖体形成、DNA错配修复等的调节过程（图7）。

图6 MCM8共表达基因的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of MCM8 co-expressed gene based on cBio-Portal

图7 MCM8相互作用蛋白网络的KEGG-pathway富集分析Fig.7 KEGG-pathway enrichment analysis of MCM8 in⁃teracting protein network

2.7 MCM8蛋白的相互作用网络 根据cBio-Portal数据库分析TCGA 胃癌数据库中与MCM8 共表达的基因，结合STRING 数据库，构建MCM8 相互作用蛋白网络（图8A），结果显示MCM8 蛋白与CDC、POLA家族的分子密切相关。通过GEPIA 数据库进一步验证上述网络中的蛋白与MCM8 间的关系后，发现与MCM8 最紧密相关的蛋白包括POLA1、ORC1、CDC7、CDC45（图8B~E）。

图8 MCM8蛋白相互作用网络及其相关性Fig.8 Network of interaction protein with MCM8 and correlations between them

3 讨论

近年来胃癌的发病率和死亡率呈持续上升趋势，目前根治性胃切除术是胃癌的唯一治疗方法，对局部进展期胃癌进行了完全手术切除的患者，辅以化疗，可将其5 年总生存率（OS）提高10%~15%［19-22］。尽管传统治疗确实为胃癌患者带来了生存益处，但许多患者在术后辅助治疗后再度复发，这表明肿瘤的异质性有助于其逃避细胞毒性治疗［23］。因此，本文基于生物信息学分析MCM8 对胃癌发生发展过程中的信号通路及肿瘤微环境的改变进行研究，以期为胃癌诊断、治疗、预后评估提供新思路。

MCM8 基因包括19 个外显子，位于20p12.3-13染色体带处与GCD10 的相对位置，编码一个由840个氨基酸组成的蛋白质，在DNA 复制起始、延伸、转录、染色体重构和基因组稳定中起重要作用［24］。本研究通过GEO、TCGA 数据库分析了MCM8 在胃癌与癌旁组织中mRNA 水平的差异表达，并收集临床组织样本，通过免疫组化染色进一步验证了其在蛋白水平的表达差异。分析MCM8表达水平与胃癌患者生存率间的关系后发现：MCM8 低表达的胃癌患者，其总体生存率显著升高；在HER2阴性的胃癌患者中，MCM8 低表达的胃癌患者的OS 及PPS 均有显著升高，表明MCM8 可以作为HER2 阴性胃癌患者较好的预后分子诊断标志物。

肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程不仅与肿瘤细胞所发生分子事件有关，也与肿瘤微环境的生物学环境有关，还可以是肿瘤细胞与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）间相互作用形成［25］。TME 是指与肿瘤的发生密切相关的局部稳态环境，主要由肿瘤细胞以及免疫细胞、内皮细胞、细胞因子、多种基质细胞、趋化因子等组成［26］。TME 可通过多种机制导致机体对肿瘤的免疫监视和免疫耐受失衡，从而促进肿瘤生长。DC细胞是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。成熟DC能有效激活初始T细胞，处于启动、调控并维持免疫应答的中心环节。在肿瘤患者中，DC主要将肿瘤细胞表面分子标志物和代谢产物等呈递给细胞毒性T细胞，进而杀伤肿瘤细胞，近年来作为恶性肿瘤免疫治疗因子被广泛研究［27-28］。本研究通过TISIDB 数据库分析发现MCM8的表达与肿瘤浸润DC 细胞表达丰度呈负相关，表明MCM8 可能通过改变TME 参与机体对肿瘤免疫监视的逃避过程。肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infil‑trating lymphocytes，TILs）是 TME 的主要成分之一，是存在于肿瘤间质中的一类异质性淋巴细胞群，以T 细胞、B 细胞和NK 细胞为代表，近年来被用于肿瘤的过继免疫治疗。研究表明，高浸润丰度的TILs是宿主高效抗肿瘤免疫应答的体现，是预后良好的指标［29］。本研究发现MCM8表达量与肿瘤CD8+T 细胞、B 细胞、NK 细胞浸润丰度呈负相关，表明MCM8基因高表达的胃癌患者预后较差，这与前面对MCM8基因表达量与胃癌患者总体生存率的分析结果相一致。有学者指出，分化程度高、直径<5 cm 的胃癌患者，其肿瘤浸润CD4+T 细胞表达丰度明显高于分化差、直径≥5 cm 的胃癌患者［30］。因此，本研究中MCM8表达量与肿瘤微环境中CD4+T细胞表达丰度呈正相关的结论应结合胃癌患者的肿瘤分级、瘤体大小进一步细化。若以MCM8 作为治疗靶点，理论上不仅可显著提高胃癌患者的OS，还可提高肿瘤浸润 CD8+T 细胞、B 细胞、NK 细胞、DC 细胞的表达丰度，亦有利于胃癌患者的过继免疫治疗。

综上所述，MCM8可以作为胃癌诊断、预后评估的一个良好的生物学标志物，具有很好的应用前景，后续本课题组将继续通过体外细胞实验结合临床数据进一步验证上述结论。