miR-150-5p 通过调控DDR1 表达对缺氧缺糖诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的影响①

王立侠 韩金芬 马明明 （郑州市第七人民医院神经电生理室，郑州450000）

缺血性脑卒中又称脑梗死，是由脑部供血障碍而引起的局限性脑组织缺血性坏死或脑软化，其发病率和致残率较高，是导致人类死亡和残疾的主要原因之一［1-2］。研究显示，miRNA 在急性缺血性脑卒中发生发展中具有重要作用［3］。研究报道，miR-150-5p 与缺血性脑卒中患者二级预防治疗的中期预后有关，参与脑血栓形成的生理病理过程［4］。缺血性脑卒中患者外周血miR-150-5p 表达显著降低，可作为缺血性脑卒中的生物标志物［5］。盘状结构域受体1（discoidin domain receptor 1，DDR1）是一种受体型蛋白酪氨酸激酶，其激活可活化一系列细胞内外信号传导，参与多种疾病过程［6］。抑制DDR1 活化可降低缺氧缺血脑损伤新生鼠皮层组织中微管相关蛋白Tau 磷酸化水平，促进乙酰胆碱释放，DDR1 抑制剂对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有保护作用［7］。但miR-150-5p对缺血性脑损伤的影响及机制尚未阐明。研究发现，缺氧缺糖可导致神经元损伤［8］。本研究采用缺氧缺糖（oxygen-glucose depri‑vation，OGD）处理大鼠大脑皮质神经细胞建立神经损伤模型，探究miR-150-5p对OGD 诱导的大鼠大脑皮质神经细胞损伤的影响及其机制是否与DDR1相关，为相关脑疾病治疗提供新的生物标志物和靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级孕16~18 d SD 大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.1.2 主要试剂与仪器 Neurobasal 培养基、B27、高糖DMEM、无糖DMEM 培养基购自美国Gibco 公司；胎牛血清购自Hyclone 公司；荧光定量试剂盒购自美国 Progema 公司；RIPA 蛋白裂解液、BCA 试剂盒购自江苏碧云天公司；MTT 试剂盒购自美国Sig‑ma 公司；乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）、碘化丙啶（PI）试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京So‑larbio 公司；CO2孵育箱、Thermo FC 酶标仪购自美国Thermo 公司；FACSCanto Ⅱ流式细胞仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮质神经细胞分离培养 无菌条件下分离大鼠大脑皮层组织，剪成1~2 mm3组织块，0.25%胰蛋白酶消化15 min，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基终止消化，离心得细胞沉淀，重悬，过200 目筛，离心，置于神经元专用培养基（98%Neurobasal+2%B27），轻轻吹打制成细胞悬液，接种于预先包被过L-多聚赖氨酸的6 孔板中，37℃、5%CO2培养。

1.2.2 OGD模型建立与细胞分组 取培养5 d的原代大脑皮层神经元，弃培养基，加入无糖DMEM培养基（无糖DMEM 预先放入缺氧培养箱中去除培养基中的氧气），置于缺氧培养箱（37℃、95%N2、5%CO2）进行OGD 培养90 min，换为神经元专用培养基继续培养，正常对照（Con）组不做任何OGD 处理。将miRNC、miR-150-5p、anti-miR-NC、anti-miR-150-5p 转染至皮层神经细胞，记为miR-NC组、miR-150-5p组、an‑ti-miR-NC 组、anti-miR-150-5p 组；将 miR-NC、miR-150-5p、si-NC、si-DDR1 转染至皮层神经细胞后进行OGD 处理，记为 OGD+miR-NC 组、OGD+miR-150-5p组、OGD+si-NC 组、OGD+si-DDR1 组；将 miR-150-5p分别与pcDNA、pcDNA-DDR1 共转染至皮层神经细胞后再进行OGD 处理，记为OGD+miR-150-5p+pcD‑NA组、OGD+miR-150-5p+pcDNA-DDR1组。

1.2.3 RT-qPCR 检测 miR-150-5p、DDR1 mRNA 表达 提取细胞总RNA，反转录为cDNA，按荧光定量说明进行PCR反应，各样品设3个重复，反应条件为95℃ 30 s，60℃ 40 s；72℃ 30 s，共40 个循环；60℃ 延长 5 min，2−ΔΔCt法计算。miR-150-5p 和 DDR1 分别以U6 和 GAPDH 为 内 参 ，miR-150-5p F：5'-CGCTCTCTCCCAACCCTTGTACC-3'，R：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 F：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'；DDR F：5'-ACTTTGGCATGAGCCGGAAC-3'，R：5'-ACGTCACTCGCAGTCGTGAAC-3'；GAPDH F：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，R：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 Western blot 法检测 DDR1、Bcl-2、Bax 蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量，配胶，上样，SDS-PAGE 转膜，封闭液封闭90 min，加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，底物反应、显影、定影，扫描仪扫描胶片，Image软件分析各目的条带灰度值，以GAPDH 为内参，分析各组目的蛋白表达。

1.2.5 MTT 检测细胞存活率 收集细胞，加入MTT 孵育 4 h，吸取上清，加入 DMSO，摇匀，酶标仪测量吸光度（OD）。细胞存活率（%）=OD实验组/OD空白对照组×100%。

1.2.6 LDH释放率检测 收集培养基上清和细胞，根据说明书进行LDH释放量检测。LDH释放率（%）=LDH上清/（LDH上清+LDH细胞）×100%。

1.2.7 细胞凋亡率检测 收集细胞，预冷PBS 漂洗，加入结合缓冲液重悬，加入Annexin V-FITC和PI混匀后避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.2.8 双荧光素酶报告实验验证miR-150-5p 和DDR1 靶向关系 构建含miR-150-5p 结合位点的DDR1 野生型载体和突变型载体，分别与miR-NC、miR-150-5p共转染至皮层神经细胞中，转染48 h，根据说明书检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行统计学分析，数据以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-150-5p 和 DDR1 在 OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞中的表达 与对照组相比，OGD 组大鼠皮质神经细胞中miR-150-5p 表达降低，DDR1 mRNA和蛋白表达升高（P<0.05，图1、表1）。

表1 miR-150-5p 和DDR1 在OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞中的表达（，n=9）Tab.1 Expressions of miR-150-5p and DDR1 in OGD-in⁃duced rat cortical neural cells（，n=9）

表1 miR-150-5p 和DDR1 在OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞中的表达（，n=9）Tab.1 Expressions of miR-150-5p and DDR1 in OGD-in⁃duced rat cortical neural cells（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05.

DDR1 protein 0.56±0.05 0.92±0.081）11.448 0.000 Groups Con OGD t P miR-150-5p 1.00±0.08 0.43±0.041）19.118 0.000 DDR1 mRNA 1.01±0.09 3.42±0.341）20.557 0.000

图1 DDR1蛋白表达Fig.1 Expression of DDR1 protein

2.2 miR-150-5p 过表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞存活率和LDH 释放的影响 与对照组相比，OGD 组miR-150-5p 表达降低，细胞存活率降低，LDH 释放率升高（P<0.05）；与 OGD+miR-NC 组相比，OGD+miR-150-5p 组 miR-150-5p 表达升高，细胞存活率升高，LDH释放率降低（P<0.05，表2）。

表2 miR-150-5p 过表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞存活率和LDH释放的影响（，n=9）Tab.2 Effect of miR-150-5p overexpression on survival rate and LDH release of rat cortical neurons in⁃duced by OGD（，n=9）

表2 miR-150-5p 过表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞存活率和LDH释放的影响（，n=9）Tab.2 Effect of miR-150-5p overexpression on survival rate and LDH release of rat cortical neurons in⁃duced by OGD（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with OGD+miRNC group，2）P<0.05.

miR-150-5p Groups Survival rate（%）1.00±0.08 0.42±0.041）0.41±0.03 0.86±0.082）215.745 0.000 Con OGD OGD+miR-NC OGD+miR-150-5p F P 100.00±13.26 48.25±4.361）45.28±4.57 78.69±7.252）91.449 0.000 LDH release rate（%）9.25±0.93 36.21±3.541）39.47±3.85 14.29±1.442）276.368 0.000

2.3 miR-150-5p 过表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞凋亡的影响 与对照组相比，OGD 组细胞凋亡率升高，Bcl-2 表达降低，Bax 表达升高（P<0.05）；与 OGD+miR-NC 组相比，OGD+miR-150-5p 组细胞凋亡率降低，Bcl-2 表达升高，Bax 表达降低（P<0.05，图2、表3）。

图2 miR-150-5p 过表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of miR-150-5p overexpression on OGD-in⁃duced apoptosis of rat cortical neurons

表3 miR-150-5p 过表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞凋亡的影响（，n=9）Tab.3 Effect of miR-150-5p overexpression on OGD-in⁃duced apoptosis of rat cortical neurons（，n=9）

表3 miR-150-5p 过表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞凋亡的影响（，n=9）Tab.3 Effect of miR-150-5p overexpression on OGD-in⁃duced apoptosis of rat cortical neurons（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with OGD+miRNC group，2）P<0.05.

Bax protein 0.31±0.03 0.76±0.071）0.77±0.06 0.38±0.042）195.164 0.000 Groups Con OGD OGD+miR-NC OGD+miR-150-5p F P Apoptotic rate（%）7.36±0.74 26.58±2.611）28.36±2.71 11.69±1.132）250.038 0.000 Bcl-2 protein 0.69±0.06 0.23±0.031）0.22±0.03 0.61±0.062）245.167 0.000

2.4 抑制DDR1 表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的影响 与OGD+si-NC 组相比，OGD+si-DDR1 组 DDR1 表达降低，细胞存活率升高，LDH 释放率降低，细胞凋亡率降低，Bcl-2 表达升高，Bax 表达降低（P<0.05，图3、表4）。

表4 抑制DDR1表达对OGD诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的影响（，n=9）Tab.4 Effect of DDR1 expression inhibition on OGD-induced rat cortical neuronal injury（，n=9）

表4 抑制DDR1表达对OGD诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的影响（，n=9）Tab.4 Effect of DDR1 expression inhibition on OGD-induced rat cortical neuronal injury（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with OGD+si-NC group，2）P<0.05.

Bax protein 0.32±0.03 0.75±0.071）0.77±0.06 0.42±0.042）171.600 0.000 Groups Con OGD OGD+si-NC OGD+si-DDR1 F P DDR1 protein 0.51±0.05 0.93±0.081）0.95±0.09 0.59±0.052）95.692 0.000 Survival rate（%）100.00±9.32 49.32±4.331）46.28±4.71 71.36±7.252）123.065 0.000 LDH release rate（%）8.36±0.84 38.41±3.881）41.25±4.31 19.65±1.872）233.033 0.000 Apoptotic rate（%）6.59±0.66 27.39±2.771）28.43±2.85 15.62±1.512）209.584 0.000 Bcl-2 protein 0.68±0.06 0.22±0.021）0.21±0.03 0.56±0.052）277.743 0.000

图3 抑制DDR1 表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of DDR1 expression inhibition on OGD-in⁃duced apoptosis of rat cortical neurons

2.5 miR-150-5p 靶向调控 DDR1 表达 StarBase 预测显示，miR-150-5p 与DDR1 存在结合位点（图4）。荧光素酶报告实验显示，与miR-NC 组相比，miR-150-5p 组中转染DDR1 野生型表达载体的细胞荧光素酶活性显著降低（P<0.05）；而转染DDR1 突变型表达载体的细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（表 5）。与 miR-NC 组相比，miR-150-5p 组 DDR1 表达显著升高（P<0.05），与anti-miR-NC 组相比，antimiR-150-5p组DDR1表达显著降低（P<0.05，表6）。

表5 双荧光素酶报告实验（，n=9）Tab.5 Double luciferase report experiments（，n=9）

表5 双荧光素酶报告实验（，n=9）Tab.5 Double luciferase report experiments（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

MUT-DDR1 1.01±0.08 1.03±0.07 0.564 0.580 Groups miR-NC miR-150-5p t P WT-DDR1 1.00±0.09 0.44±0.041）17.058 0.000

表6 miR-150-5p调控DDR1蛋白表达（，n=9）Tab.6 miR-150-5p regulates DDR1 protein expression（，n=9）

表6 miR-150-5p调控DDR1蛋白表达（，n=9）Tab.6 miR-150-5p regulates DDR1 protein expression（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05；compared with antimiR-NC group，2）P<0.05.

DDR1 protein 0.55±0.05 0.22±0.021）0.53±0.04 0.96±0.082）304.404 0.000 Groups miR-NC miR-150-5p anti-miR-NC anti-miR-150-5p F P

图4 miR-150-5p靶向调控DDR1表达Fig.4 miR-150-5p targets DDR1 expression

2.6 DDR1 过表达逆转miR-150-5p 过表达对OGD诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的作用 与OGD+miR-150-5p+pcDNA 组相比，OGD+miR-150-5p+pcD‑NA-DDR1 组DDR1 表达升高，细胞存活率降低，LDH释放率升高，细胞凋亡率升高，Bcl-2表达降低，Bax表达升高（P<0.05，表7、图5）。

表7 DDR1过表达逆转miR-150-5p过表达对OGD诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的作用（，n=9）Tab.7 DDR1 overexpression reverses effect of miR-150-5p overexpression on OGD-induced rat cortical neuronal injury（，n=9）

表7 DDR1过表达逆转miR-150-5p过表达对OGD诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的作用（，n=9）Tab.7 DDR1 overexpression reverses effect of miR-150-5p overexpression on OGD-induced rat cortical neuronal injury（，n=9）

Note：Compared with OGD+miR-NC group，1）P<0.05；compared with OGD+miR-150-5p+pcDNA group，2）P<0.05.

Groups DDR1 protein Survival rate（%）Bcl-2 protein Bax protein 0.78±0.07 0.37±0.031）0.35±0.04 0.67±0.062）152.155 0.000 OGD+miR-NC OGD+miR-150-5p OGD+miR-150-5p+pcDNA OGD+miR-150-5p+pcDNA-DDR1 F P 0.94±0.08 0.43±0.041）0.42±0.03 0.81±0.072）183.478 0.000 44.39±4.28 77.58±7.751）79.65±7.36 52.11±5.322）71.169 0.000 LDH release rate（%）37.54±3.87 13.46±1.331）12.58±1.26 31.65±3.142）205.674 0.000 Apoptotic rate（%）27.55±2.71 11.02±1.131）10.47±1.08 22.32±2.252）173.887 0.000 0.22±0.03 0.62±0.061）0.63±0.05 0.32±0.032）199.101 0.000

图5 DDR1 过表达逆转miR-150-5p 过表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞凋亡的作用Fig.5 DDR1 overexpression reverses effect of miR-150-5p overexpression on OGD-induced rat cortical neuro⁃nal apoptosis

3 讨论

缺血性脑损伤是临床常见疾病，缺血性神经细胞凋亡与脑损伤发生密切相关，研究其作用分子机制对脑损伤防治具有重要意义［9］。氧化应激在缺血缺氧性脑损伤中具有重要作用［10］。本研究采用OGD 法诱导大鼠大脑皮质神经细胞，结果显示，细胞存活率降低，LDH 释放率升高，细胞凋亡率升高，说明OGD 可诱导大脑皮质神经细胞凋亡和氧化应激。研究报道，miR-24 抑制剂可预防缺血性卒中神经元凋亡［11］。miR-let-7c-5p 过表达通过抑制神经炎症和调节小胶质细胞活化，改善创伤性脑损伤诱导的神经功能障碍和脑水肿［12］。说明miRNA 参与调控缺血性卒中及脑神经损伤。较低水平的miR-150-5p 与死亡率独立相关，miR-150-5p 可降低急性缺血性中风后 90 d 内的死亡率风险［13］。miR-150 通过调节细胞凋亡保护小鼠心脏免受缺血性损伤［14］。本研究结果显示，OGD 诱导的皮质神经细胞中miR-150-5p 呈低表达。过表达miR-150-5p，细胞存活率升高，LDH释放率降低，细胞凋亡率降低，Bcl-2表达升高，Bax 水平降低，提示过表达miR-150-5p 可促进细胞存活，抑制LDH 释放和细胞凋亡，可保护OGD诱导的大脑皮质神经细胞损伤。

研究报道，氧糖剥夺损伤的神经元细胞中DDR1 蛋白表达增加［15］。大鼠局灶性脑缺血后DDR1表达升高，DDR1可能在脑缺血再灌注后破坏血脑屏障中起关键作用［16］。miR-199a-5p 通过下调大鼠DDR1预防脑缺血性损伤［17］。高迁移率簇蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）通过上调DDR1 表达和下调心肌细胞缺氧/复氧损伤后雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）磷酸化促进细胞凋亡和上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT），并诱导自噬［18］。本研究显示，OGD 诱导的皮质神经细胞中DDR1 呈高表达，抑制DDR1表达可促进细胞存活，减少LDH释放和细胞凋亡，且miR-150-5p 靶向调控DDR1，DDR1过表达逆转miR-150-5p 过表达对OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的保护作用。

综上所述，过表达miR-150-5p 可能通过下调DDR1 表达保护OGD 诱导的大鼠皮质神经细胞损伤，为治疗缺血性脑损伤相关疾病提高新思路和靶点。