LINC00467通过靶向miR-495-3p调控视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡①

李思莹 周萍萍 齐艳秀 张 剑 王玉清 （佳木斯大学附属第一医院眼科，佳木斯154002）

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）是一种常见致死性眼内肿瘤，高发于儿童［1］。与其他恶性肿瘤相比，Rb发病率较低，但若治疗不当则发展迅速，常发生脑转移，死亡率较高［2］。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是长度大于200 个核苷酸的缺乏蛋白编码能力的RNA，通过调节肿瘤相关基因或通路发挥致癌基因或抑癌基因功能，与肿瘤细胞增殖、凋亡、周期阻滞和侵袭有关［3-4］。多个与肿瘤相关的lncRNA 参与Rb进展，并是Rb的诊断标志物和治疗靶点［5］。LINC00467 是近年发现的肿瘤相关RNA，研究显示，LINC00467高表达与结肠癌患者总体生存期、无复发生存期较短有关，下调LINC00467 表达可抑制结直肠癌细胞增殖和转移［6］。肝癌中 LINC00467 呈高表达，可抑制肝癌细胞生长和转移，促进细胞凋亡［7］。生物信息学分析显示，miR-495-3p 是LINC00467 的潜在靶基因。miR-495-3p 已被证实在骨肉瘤中具有抑癌基因作用［8］，但 LINC00467 是否具有抗 Rb 作用，其作用是否与调控miR-495-3p 表达有关尚未阐明。本研究探讨 LINC00467、miR-495-3p 在 Rb 中的生物学作用，以期为Rb分子治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器 人Rb 细胞系Y79（美国菌种保藏中心）；胎牛血清（美国Hyclone 公司）；RP‑MI1640 培养液（美国Gibco 公司）；TRIzol 试剂（美国Invitrogen公司）；PrimeScript RT 试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Promega 公司）；SYBR Premix ExTaq、Mir-X miRNA First Strand Synthesis 试剂盒（中国TaKaRa 公司）；LINC00467特异性小干扰RNA（si-LINC00467）、乱序无意义阴性对照序列（si-NC）、miR-495-3p 模拟物（miR-128-3p mimics）、模拟物阴性对照（miR-NC）、miR-495-3p 抑制物（antimiR-182-5p）、抑制物对照（anti-NC）由上海吉玛制药公司提供；MTT（美国Sigma 公司）；膜联蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒（上海钰博生物公司）；兔抗人细胞周期素D1（CyclinD1）、p21、B 细胞淋巴瘤2（B cell lym‑phoma 2，Bcl-2）、Bcl 相关 X 蛋白（Bcl associated X protein，Bax）、GAPDH 抗体及山羊抗兔二抗（上海艾博抗公司）；酶标仪（美国Thermo公司）；流式细胞仪（美国BD公司）。

1.1.2 组织来源 收集2014 年至2018 年我院病理科确诊的 25 例 Rb 标本，男性 14 例，女性 11 例，年龄6 个月~16 岁，另取25 例正常视网膜组织，男性18 例，女性 7 例，年龄 5~14 岁。Rb 标本在摘除手术中采集，术前均未接受放化疗治疗，正常视网膜组织来源于意外死亡捐献者。本研究经我院伦理委员会批准，所有研究对象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 Y79 细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，37℃、5%CO2培养至对数生长期，接种于6 孔板，当细胞密度达60%时按Lipofectamine 2000使用说明将si-NC、si-LINC00467、miR-NC、miR-495-3p mimics、si-LINC00467+anti-miRNC、si-LINC00467+anti-miR-495-3p 分别转染至 Y79细胞，转染48 h 时，检测转染效率，合格后进行后续实验。

1.2.2 RT-qPCR 检 测 LINC00467 和 miR-495-3p 表达 采用TRIzol试剂提取Rb组织、正常视网膜组织总RNA，采用PrimeScript RT 试剂盒进行逆转录，分别采用SYBR Premix ExTaq、Mir-X miRNA First Strand Synthesis 试 剂 盒 测 定 LINC00467 和 miR-495-3p 表达，2−ΔΔCt法计算，LINC00467 以 GAPDH 为内参，miR-495-3p 以 U6 为内参，引物序列（5'-3'）：LINC00467 F：ATTGAAGATGCTGCCAAGGG，R：GCCCAGTTTCAGTCCCTCTT；GAPDH F：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA，R：AATGAAGGGGTCATTGATGG；miR-495-3p F：GCGGAAACAAACATGGTGCA；U6 F：TCCGATCGTGAAGCGTTC，R：GTGCAGGGTCCGAGGT。

1.2.3 MTT 法检测细胞增殖活力 转染48 h 后，收集Y79 细胞，采用RPMI1640 培养基制备细胞密度为3×104个/ml的单细胞悬液，取0.1 ml细胞悬液加入96 孔板，常规培养24 h、48 h、72 h，20 µ/l 孔加入MTT 试剂（5 mg/ml），反应4 h，终止培养，弃孔内培养液，150µ/l 孔加入二甲基亚砜，摇床低速振荡10 min，酶标仪检测490 nm 处各孔光密度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 转染48 h 后，收集Y79 细胞，采用1×结合缓冲液制备细胞密度为1×108个/ml 的单细胞悬液，取0.1 ml 细胞悬液加入至流式管内，分别加入5µl Annexin V-FITC和PI，避光反应15 min，补加400 µl 1×结合缓冲液，轻轻混匀，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 双荧光素酶报告实验 合成含有miR-495-3p 结合位点的LINC00467 野生型序列或突变位点的突变序列，并将野生型/突变型LINC00467 序列克隆至pmirGLO 双荧光素酶载体，WT-LINC00467、MUT-LINC00467 由上海吉玛公司构建。采用Lipo‑fectamine 2000 将报告载体WT-LINC00467 或MUTLINC00467 分 别 与 miR-495-3p mimic 或 miR-NC 共转染至Y79细胞，转染48 h，双荧光素酶报告基因测定系统测定各组细胞相对荧光素酶活性。

1.3 统计学分析 所有实验均设置3个平行实验，重复 3 次，数据以表示。采用 SPSS19.0 软件进行统计学分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Rb 组织中 LINC00467 和 miR-495-3p 表达 与正常视网膜组织（1.00±0.06）、（1.02±0.09）相比，Rb 组织中 LINC00963 表达（4.22±0.41）显著升高，miR-495-3p表达（0.58±0.05）显著降低（P<0.05）。

2.2 抑制LINC00467 表达对 Y79 细胞增殖的影响 与转染si-NC 组相比，转染si-LINC00467 后Y79细胞LINC00467 表达显著降低（P<0.05），表明Y79细胞中LINC00467表达受抑制。抑制LINC00467表达，Y79 细胞24~72 h 细胞活力显著降低，CyclinD1蛋白表达显著降低，p21 蛋白表达显著升高（P<0.05），见图1、表1。

表1 抑制LINC00467表达对Y79细胞增殖的影响（，n=9）Tab.1 Effect of inhibiting LINC00467 on proliferation of Y79 cells（，n=9）

表1 抑制LINC00467表达对Y79细胞增殖的影响（，n=9）Tab.1 Effect of inhibiting LINC00467 on proliferation of Y79 cells（，n=9）

Groups LINC00467 OD490 CyclinD1 protein p21 protein si-NC si-LINC00467 t P 1.01±0.06 0.43±0.04 24.129 0.000 24 h 0.29±0.03 0.24±0.03 3.536 0.003 48 h 0.53±0.05 0.37±0.04 7.496 0.000 72 h 0.81±0.08 0.49±0.04 10.733 0.000 0.65±0.06 0.24±0.03 18.336 0.000 0.18±0.02 0.58±0.05 22.283 0.000

图1 增殖相关蛋白表达Fig.1 Expressions of proliferation-related proteins

2.3 抑制LINC00467 表达对Rb 细胞Y79 凋亡的影响 与si-NC 组（6.25±0.63）、（0.75±0.07）、（0.27±0.03）相比，抑制 LINC00467 表达，Y79 细胞凋亡率（23.47±2.33）显著升高，Bcl-2 蛋白表达（0.31±0.03）显著降低，Bax 蛋白表达（0.69±0.06）显著升高（P<0.05），见图2。

图2 抑制LINC00467表达对Y79细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of inhibiting LINC00467 on apoptosis of Y79 cells

2.4 LINC00467 靶向调控 miR-495-3p 表达 Lnc‑Base Predicted v. 2 网站在线预测显示，LINC00467与miR-495-3p 存在连续互补的结合位点（图3）。双荧光素酶报告显示，与转染miR-NC 和WT-LINC 00467 共转染组（1.00±0.06）相比，miR-495-3p mim‑ics 和 WT-LINC00467 共转染组（0.52±0.05）Y79 细胞荧光素酶活性显著降低（P<0.05）；与转染miRNC 和MUT-LINC00467 共转染组（1.04±0.07）相比，miR-495-3p mimics 和 MUT-LINC00467 共 转 染 组Y79 细胞荧光素酶活性（1.01±0.08）差异无统计学意义。Western blot 检测显示，与转染pcDNA 组（1.00±0.05）相比，转染 pcDNA-LINC00467 后 Y79细胞miR-495-3p 表达（0.55±0.04）显著降低；与转染 si-NC 组（0.98±0.07）相比，转染si-LINC00467 后Y79 细胞 miR-495-3p 表达（2.79±0.27）显著升高（P<0.001）。

图3 LINC00467 序列中存在与miR-495-3p 互补的核苷酸序列Fig.3 Sequence of LINC00467 contains a nucleotide se⁃quence complementary to miR-495-3p

2.5 miR-495-3p过表达对Rb 细胞Y79增殖和凋亡的影响 与转染miR-NC 组相比，转染miR-495-3p mimic 后 Y79 细胞 miR-495-3p 表达显著升高（P<0.05），表明 Y79 细胞 miR-495-3p 表达上调成功。过表达 miR-495-3p，Y79 细胞 24~72 h 活力显著降低，凋亡率显著升高，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达显著降低，p21 和Bax 蛋白表达显著升高（P<0.05），见图4、表2。

表2 miR-495-3p过表达对Y79细胞增殖和凋亡的影响（，n=9）Tab.2 Effects of overexpressing miR-495-3p on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

表2 miR-495-3p过表达对Y79细胞增殖和凋亡的影响（，n=9）Tab.2 Effects of overexpressing miR-495-3p on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

Groups miR-495-3p OD490 p21 protein Bcl-2 protein Bax protein miR-NC miR-495-3p t P 1.00±0.06 3.11±0.29 21.375 0.000 24 h 0.28±0.03 0.26±0.03 1.414 0.176 48 h 0.56±0.05 0.41±0.04 7.028 0.000 72 h 0.86±0.07 0.53±0.05 11.509 0.000 Apoptosis rate（%）7.25±0.72 19.47±1.82 18.730 0.000 CyclinD1 protein 0.64±0.06 0.29±0.03 15.652 0.000 0.19±0.02 0.54±0.05 19.498 0.000 0.77±0.07 0.36±0.03 16.151 0.000 0.26±0.03 0.65±0.06 17.441 0.000

图4 miR-495-3p过表达对Y79细胞增殖和凋亡的影响Fig.4 Effect of overexpressing miR-495-3p on prolifera⁃tion and apoptosis of Y79 cells

2.6 抑制miR-495-3p 表达逆转抑制LINC00467 对Rb 细胞Y79 增殖和凋亡的作用 如图5、表3 所示，与转染 si-NC 相比，转染 si-LINC00467 后 Y79 细胞miR-495-3p表达显著升高，24~72 h时细胞活力显著降低，凋亡率显著升高，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达显著降低，p21 和Bax 蛋白表达显著升高；与转染si-LINC00467+anti-miR-NC 相比，转染 si-LINC00467+anti-miR-495-3p 后 Y79 细胞 miR-495-3p 表达显著降低，24~72 h时细胞活力显著升高，凋亡率显著降低，CyclinD1 和 Bcl-2 蛋白表达显著升高，p21 和 Bax 蛋白表达显著降低（P<0.05）。

图5 下调miR-495-3p 表达逆转抑制LINC00467 对Y79 细胞增殖和凋亡的作用Fig.5 Down-regulating miR-495-3p reverses effect of in⁃hibiting LINC00467 on proliferation and apoptosis of Y79 cells

表3 下调miR-495-3p表达逆转抑制LINC00467对Y79细胞增殖和凋亡的作用（，n=9）Tab.3 Down-regulating miR-495-3p reversed effect of inhibiting LINC00467 on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

表3 下调miR-495-3p表达逆转抑制LINC00467对Y79细胞增殖和凋亡的作用（，n=9）Tab.3 Down-regulating miR-495-3p reversed effect of inhibiting LINC00467 on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05；compared with si-LINC00467+anti-miR-NC group，2）P<0.05.

Groups miR-495-3p Apoptosis rate（%）CyclinD1 protein p21 protein Bcl-2 protein Bax protein si-NC 1.01±0.06 OD490 24 h 0.28±0.03 48 h 0.55±0.05 72 h 0.84±0.087.65±0.740.64±0.060.17±0.020.76±0.070.28±0.03 si-LINC00467 si-LINC00467+anti-miR-NC si-LINC00467+anti-miR-495-3p 2.75±0.271）0.23±0.031）0.38±0.041）2.79±0.28 1.43±0.142）0.22±0.02 0.27±0.022）0.34±0.03 0.49±0.042）0.51±0.051）0.46±0.04 0.72±0.072）22.41±2.241）24.63±2.45 11.05±1.172）0.25±0.031）0.23±0.03 0.53±0.052）0.57±0.051）0.59±0.06 0.29±0.032）0.32±0.031）0.30±0.03 0.64±0.052）0.67±0.061）0.68±0.07 0.39±0.042）171.33512.00051.27374.396193.899190.291210.649208.043132.764 0.000 F P 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

3 讨论

近年研究表明，lncRNA 在Rb 进展中具有重要作用。WANG等［9］研究表明，下调核丰富的转录本1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）可显著抑制Rb 细胞增殖、细胞周期进展，增强caspase-3和 caspase-9 活性，促进细胞凋亡。LI 等［10］研究发现，体内外抑制LINC00152均可显著抑制Rb细胞生长。本研究揭示了LINC00467在Rb中的作用，并证实其作用发挥与调控miR-495-3p表达有关。

LINC00467 位于染色体1q32.3 区域，全长2 616 nt。研究显示，LINC00467 在胶质瘤、肺腺癌、宫颈癌等多种癌症中表达上调，促进肿瘤细胞增殖和迁移，促进肿瘤发生发展，表明LINC00467在上述类型肿瘤中起抑癌基因作用［11-14］。但LINC00467 在Rb 中的表达和作用鲜有报道。本研究显示，LINC00467 在Rb 组织中表达上调，提示LINC00467可能参与Rb 进展。此外，本研究验证了LINC00467的生物学功能，表明抑制LINC00467 表达可显著抑制Y79细胞增殖，诱导其凋亡。增殖、凋亡关键蛋白检测发现，抑制LINC00467 表达可降低CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达，升高 p21 和 Bax 蛋白表达，表明LINC00467在Rb中起致癌基因作用。

lncRNA 通过与miRNA 结合降低其表达发挥ceRNA 功能是其参与肿瘤调控的重要机制。研究显示，核内小RNA 宿主基因16（small nuclear RNA host gene 16，SNHG16）通过海绵miR-140-5p 促进人Rb 进展［15］；抑制同源盒基因 A11 反义 RNA（homolo‑gous box gene A11 antisense RNA，HOXA11-AS）通过上调miR-506-3p 表达可明显抑制Rb 细胞增殖，诱导细胞周期G/1G0期阻滞，促进细胞凋亡［16］。本研究以miR-495-3p 作为LINC00467 的下游靶点，并通过双荧光素酶报告基因实验、RT-qPCR 证实LINC00467对miR-495-3p的靶向负调控作用。既往研究显示，miR-495-3p 在结肠癌、黑色素瘤中表达下调，抑制NEAT1通过上调miR-495-3p可触发结肠癌细胞凋亡，抑制黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭［17-18］。此外，miR-495-3p 还是胃癌细胞自噬平衡和多药耐药的重要调节因子［19］。本研究显示，miR-495-3p 在Rb 组织中表达降低，转染miR-495-3p mimics 上调其表达可抑制Y79 细胞增殖，抑制Cy‑clinD1 和 Bcl-2 表达，促进 p21 和 Bax 表达，诱导细胞凋亡。此外，恢复实验显示，抑制miR-140-5p 表达可逆转抑制LINC00467对Y79细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。表明LINC00467 通过miR-140-5p 参与Y79细胞增殖和凋亡调控。

综上所述，本研究表明，LINC00467 在 Rb 中表达上调，通过与miR-506-3p 直接作用在Rb 发生中发挥致癌作用。因此，LINC00467 有望成为Rb 潜在治疗靶点。