细胞焦亡在急性肺损伤小鼠肺巨噬细胞中的调控机制研究

牛毓茜 李桂云 杨丽秋 张嵘耀 代 颖 （贵阳市第二人民医院呼吸与危重症医学科，贵阳550081）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是临床常见的呼吸系统疾病之一，多见于ICU患者，且发病原因以脓毒血症为主［1］。ALI病情发展较快，其主要临床表现为急性呼吸窘迫综合征。体外膜肺氧合和机械通气是治疗ALI 较常见的方法，但由于ALI 发病率和死亡率较高，且缺少良好的治疗药物，其治疗效果仍然不够理想。因此，探究ALI的发病机制，寻找可用的生物标志物和治疗靶点，对提高ALI 的治疗效果和预后具有重要意义。细胞焦亡作为一种促炎的细胞程序性死亡方式，与凋亡或坏死不同的是，细胞焦亡介导的细胞死亡必须要caspase-1 或caspase-11 通过剪切 GSDMD 蛋白来发挥作用［2-3］。其可诱导炎症细胞肿胀、裂解，胞内促炎物质会大量释放，使机体迅速产生强劲的炎症反应。近年研究发现，阻滞促炎因子和TLR4对脓毒症患者ALI的预后并无明显改善作用。提示除促炎因子和TLR4外，可能还有其他介质影响ALI 的发生发展［4］。最新研究发现，敲除小鼠细胞焦亡相关caspase-1 和NLRP-3基因可减少LPS介导的脓毒症小鼠肺损伤，表明细胞焦亡在脓毒症ALI 发病中具有重要作用［5］。但细胞焦亡在ALI 中作用的具体机制尚缺少文献报道。为进一步考察细胞焦亡在ALI中的作用机制，本研究拟采用与细胞焦亡关系密切的NF-κB信号通路，考察其对ALI 小鼠肺巨噬细胞焦亡的影响；同时对NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1等NF-κB通路相关信号分子水平进行检测，以期获得引起ALI的部分可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取24 只健康C57BL/6J 雄性小鼠，4~6周龄，体重18~22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2018-0003，适应性饲养1 周，期间给予自由饮水和饮食，光照白天和黑夜各12 h。

1.1.2 主要试剂 脂多糖（生产批号：M3148-25ML，美国Sigma 公司）；IL-6、IL-1β、TNF-α 和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）ELISA 试剂盒（产品货号分别为：E-EL-R0355c、E-EL-R0047c、E-EL-R0054c、E-EL-R0013c，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；抗NF-κB（单克隆兔抗）、抗p65（单克隆鼠抗）、抗NLRP3（单克隆兔抗）、抗caspase-1 抗体（单克隆兔抗）（产品货号分别为：43966S、14472S、8480S、13667S，Cell Signaling Technology）；DAPI 染色试剂盒（产品货号：BB-4133-100T，南京立乔生物科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器 SSW-3型显微外科手术器械包，上海手术器械厂；纤维素滤膜（0.22µm）、混合纤维素滤膜（0.45 µm），德国 BM；-80℃超低温冰箱，青岛海尔集团；4℃、-20℃冰箱，合肥美菱股份有限公司；H1650-W 离心机，湖南湘仪实验室仪器有限公司；TGL-20M 高速台式冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器有限公司；CKX41倒置显微镜、IX-71荧光倒置显微镜，日本Olympus 光学工业株式会社；Infinite M1000 Pro 全波长酶标仪，TECAN 公司；TANK‑PE060高纯水机，美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型建立［6］24 只小鼠适应性饲养1 周后，称取体重，根据体重分层随机分为正常对照组、模型组和干预组，8 只/组。模型组小鼠腹腔注射LPS（剂量：15 mg/1 000 g体重，1 m/l 100 g体重），尾静脉注射生理盐水（剂量：1 m/l 100 g 体重）建造ALI 模型，干预组在模型组的基础上尾静脉注射 NF-κB 抑制剂PDTC（剂量：100 mg/1 000 g 体重，1 m/l 100 g 体重），对照组仅腹腔注射和尾静脉注射等量生理盐水。

1.2.2 取材 依照实验设计方案，称重，造模24 h后，采用7%水合氯醛麻醉小鼠，眼眦取血处死小鼠，血液静置 30 min 后，4℃ 1 500/r min 离心 5 min，取上清液保存备用。快速开腹，分离结扎左肺，右肺穿刺盥洗，收集支气管肺泡盥洗液（BALF，约4 ml），切取左肺上叶保存于-70℃液氮备用，剩余肺组织保存于4%多聚甲醛溶液，备用。

1.2.3 巨噬细胞分离 将收集的BALF以1 000/r min离心5 min，弃上清，用含10%胎牛血清的RP‑MI1640 培养液洗涤沉淀的细胞2 次，重悬后，得到细胞悬液，调整细胞浓度为2×105个/ml 后，接种于12孔板，1 m/l 孔，37℃、5%CO2孵育1.5 h，待细胞贴壁后，PBS 洗去未贴壁的细胞，即获得肺巨噬细胞（alveolar macrophages，AM）。

1.2.4 HE 染色 ①固定：将取得的肺组织标本置于4%的甲醛溶液中充分浸泡30~50 min；②脱水：分别用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇进行梯度脱水；③透明：二甲苯将标本透明2 次，以替换标本组织内乙醇，直至标本透明似琥珀；④浸蜡：将透明标本组织置于融化好的石蜡中，于65℃溶蜡箱中保温2 h；⑤包埋：待石蜡完全浸入组织中后包埋，待其冷却凝固为蜡块后备用；⑥编号：记录为标本来源小鼠编号；⑦切片：将组织蜡块切为4µm厚的薄片；⑧贴片：将切片在热水中烫平，然后贴在玻片上，置于烤箱58℃恒温保持4 h；⑨染色：在脱蜡和水洗后，苏木素染色，保持3 min，继续水洗之后再蓝化，保持10 min，使用1%的盐酸乙醇分化20 s，最后伊红染色，保持5 min；⑩封片：梯度乙醇脱水，各自保持3 min，使用二甲苯进行透明，保持5 min，最后使用中性树脂胶完成封片。

1.2.5 ELISA 法测定血清和 BALF 中 IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1水平 严格按照ELISA 试剂盒说明书要求进行操作。

1.2.6 Western blot 定量检测肠黏膜组织中NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1的表达 取小鼠肠黏膜组织，冰上研磨30 min，将混合液小心吸入离心管中，11 000 r/min 4℃离心15 min，弃沉淀，取上清，于110 mV 下SDS-PAGE 分离蛋白质，并转至硝酸纤维膜；以20∶1的比例在PBST 溶液中加脱脂奶粉，室温条件下封闭1 h。依照一抗的推荐浓度和用量，加入奶粉对一抗进行稀释。将硝酸纤维膜置于杂交袋，加入一抗工作液，封口，4℃条件下孵育过夜。加入 HRP 标记好的二抗（抗兔 IgG 抗体，1∶2 000 稀释）工作液，再封口，37℃孵育1 h。凝胶成像分析仪扫描并分析结果。绘制标准曲线，并计算浓度，结果用相对灰度值表示。

1.2.7 DAPI染色检测巨噬细胞焦亡 巨噬细胞悬液于固定液中固定，将细胞滴加在载玻片上，干燥。固定完毕后，用免疫染色洗涤液洗涤2 次，5 min/次。加入免疫染色封闭液，封闭1 h。按照1∶1 000比例用免疫染色一抗稀释液稀释一抗。用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1 h。加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5 min，共洗涤3 次。 孵育二抗，用免疫染色二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1 h。于荧光显微镜下观察，拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 软件分析数据，计量资料数据均以表示，多组数据的比较采用ANOVA 分析，采用 Bonferroni 校正的t检验进行多重比较，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肺湿重/干重（W/D）的影响 如表1所示，与正常组相比，模型组小鼠W/D明显提高，而干预组小鼠较模型组W/D明显降低（P<0.05）。

表1 各组小鼠肺湿重/ 干重（W/ D）的影响（）Tab.1 Effect of lung wet/ dry（W/ D）of mice in each group（）

表1 各组小鼠肺湿重/ 干重（W/ D）的影响（）Tab.1 Effect of lung wet/ dry（W/ D）of mice in each group（）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

W/ D 4.12±0.21 7.12±0.341）5.24±0.261）2）Groups Normal Model Treatment n8 8 8 Weight（g）22.76±2.42 22.51±34.28 23.06±20.32

2.2 各组小鼠血清 IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 水平 由表2可知，与正常组相比，模型组小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 和 MCP-1 含量均明显升高（P<0.05）；与模型组相比，干预组IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1含量均明显降低（P<0.05）。

表2 各组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平（，n=8，pg/ ml）Tab.2 Serum IL-6，IL-1β，TNF-α and MCP-1 levels of mice in each group（，n=8，pg/ ml）

表2 各组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平（，n=8，pg/ ml）Tab.2 Serum IL-6，IL-1β，TNF-α and MCP-1 levels of mice in each group（，n=8，pg/ ml）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

MCP-1 326.2±88.6 814.5±147.21）479.3±102.31）2）Groups Normal Model Treatment IL-6 120.2±46.1 678.3±112.31）274.3±75.21）2）IL-1β 62.8±6.3 155.3±52.01）76.8±18.21）2）TNF-α 44.2±10.1 112.3±32.31）56.9±11.81）2）

2.3 各组小鼠 BALF 中 IL-6、IL-1β、TNF-α 和 MCP-1 水平 与正常组相比，模型组小鼠BALF 中IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 含量均明显升高（P<0.05）；与模型组相比，干预组IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1含量均明显降低（P<0.05），详见表3。

表3 各组小鼠BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平（，n=8，pg/ ml）Tab.3 IL-6，IL-1β，TNF-α，and MCP-1 levels in BALF of each group of mice（，n=8，pg/ ml）

表3 各组小鼠BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平（，n=8，pg/ ml）Tab.3 IL-6，IL-1β，TNF-α，and MCP-1 levels in BALF of each group of mice（，n=8，pg/ ml）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

MCP-1 384.2±77.9 908.5±164.71）497.1±99.61）2）Groups Normal Model Treatment IL-6 200.2±35.3 823.5±111.61）326.3±82.41）2）IL-1β 161.2±53.1 560.7±82.31）268.0±52.81）2）TNF-α 53.2±9.8 174.6±36.51）72.5±13.21）2）

2.4 各组小鼠肺组织病理学的影响 HE 染色结果如图1 所示，正常组小鼠肺泡结构完整且排列整齐，无变性坏死。模型组小鼠肺泡结构被破坏，存在大量炎症细胞浸润。干预组小鼠可见肺泡结构改变和炎症细胞浸润，但较模型组明显减轻。

图1 各组小鼠肺组织HE染色（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue of mice in each group（×200）

2.5 各组小鼠肺巨噬细胞焦亡 DAPI染色结果显示，正常组PI红色荧光弱，无明显细胞焦亡；模型组红色荧光明显增强，提示肺巨噬细胞存在明显焦亡。干预组小鼠肺巨噬细胞红色荧光较模型组明显减弱，与正常组差异较小，细胞焦亡现象不明显。见图2。

图2 各组小鼠巨噬细胞染色（×100）Fig.2 Macrophage staining of mice in each group（×100）

2.6 小鼠肺组织中NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1蛋白表达 Western blot 结果表明，模型组小鼠肺组织中NF-κB、p65、NLRP3 和 caspase-1 表达较正常组明显增加，而干预组NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1表达量较模型组明显减少（图3）。由此可推断，ALI小鼠可诱导NF-κB 通路激活，使NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1蛋白表达增加，促进巨噬细胞焦亡。

图3 肺组织NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1蛋白表达Fig. 3 NF-κB，p65，NLRP3 and caspase-1 protein expressions in lung tissue

3 讨论

AM与ALI的发生关系密切，是调节肺部微环境和炎症反应最重要的细胞。其主要包括肺泡、肺间充质及支气管巨噬细胞3 种，其中AM 比例最高，占90%以上［7-8］。当肺部遭受外源性致病因素刺激时，肺巨噬细胞会利用模式识别受体（包括Toll样受体、NR4A1 受体、NOD 样受体及由 PYHIN 样蛋白家族、适配器蛋白和caspase-1 三种蛋白组成的经典炎性体等）进行识别，开启机体第一道免疫防御，释放大量炎症介质［9-11］。经典炎症体 NLRP3 在各种 ALI 中均演重要角色，NLRP3 被激活时，会促进caspase-1前体活化，活化的caspase-1 可通过剪切促使无活性的白介素蛋白（如proIL-1β、proIL-6 等）变成有活性的IL-1β、IL-6 诱发炎症反应［12］。本研究利用LPS 建立ALI 小鼠模型后发现，ALI 小鼠肺组织中NLRP3表达及血清和 BALF 中 IL-6、IL-1β、TNF-α 和 MCP-1水平均较正常组小鼠明显升高，提示LPS 可激活NLRP3 炎症小体，诱导 IL-6、IL-1β、TNF-α 和 MCP-1促炎物质的释放，使机体迅速产生炎症反应，导致ALI。

4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phe‑nylindole，DAPI）能与双链 DNA 小槽，特别是 AT 碱基结合，使荧光强度增强20 倍，而与单链DNA 则无荧光增强现象，是一种简单、快速且灵敏的DNA 检测方法，被广泛用于细胞凋亡或焦亡实验［13-14］。NL‑RP3 一旦被激活还会导致下游细胞（如肺巨噬细胞等）焦亡，焦亡的细胞存在DNA 的片段化，因而可被DAPI 染成阳性［15］。本研究显示，在 LPS 介导的 ALI小鼠中，DAPI染色可见焦亡的肺巨噬细胞被染成红色，提示LPS 介导的ALI 中存在明显的肺巨噬细胞焦亡现象。

目前，已发现的引起AM 焦亡的通路包括自噬、线粒体 DNA、TNF-α 等。王振霞等［16］研究发现，利用雷帕霉素激活脓毒症小鼠自噬，可显著降低巨噬细胞焦亡和小鼠死亡率。赵宁等［17］在LPS刺激的大鼠AM 细胞中加入线粒体DNA 后发现，线粒体DNA可明显放大AM 诱导的炎症反应，促进AM 细胞焦亡。随着研究的深入，研究者发现NF-κB 在细胞凋亡和炎症反应中也具有重要作用。NICOLAY 等［18］研究发现，NF-κB 信号通路激活会诱导T 淋巴细胞凋亡，抑制NF-κB 的激活对治疗T 淋巴细胞瘤具有重要价值。XIA 等［19］研究也表明，NF-κB 途径可诱导细胞凋亡，并抑制RA-HFLS 的增殖和血管生成，可能是 RA 治疗的新靶点。CHOI 等［20］研究发现，敌草快导致的神经退行性疾病可能与其通过NF-κB介导的p53 信号传导的炎症反应诱导细胞损伤有关。但NF-κB 在AM 焦亡的机制研究尚缺少报道。本研究结果表明，ALI 小鼠肺组织中 NF-κB、p65、NLRP3 和caspase-1 表达水平较正常组明显升高，而NF-κB 抑制剂干预组小鼠 NF-κB、p65、NLRP3 和caspase-1 均较模型组明显降低，提示ALI 的发生机制可能与激活NF-κB 信号通路，促进巨噬细胞焦亡有关。

综上所述，LPS 介导的ALI 与肺巨噬细胞焦亡密切相关，其通过激活NF-κB 信号通路增加AM 细胞中NLRP3的表达，诱导细胞焦亡的发生，抑制NF-κB 信号通路的激活，降低AM 细胞焦亡，从而改善LPS 介导的ALI。但由于样本量有限，实验方法单一，且ALI 发病复杂，仍需更大的样本量、更丰富的实验方法进行验证。