C3a及C5a在45例儿童紫癜性肾炎诊断中的应用价值①

徐闪闪 王 龙 李雪军 高 敏 张 霞 丁 樱（河南中医药大学研究生处，郑州450000）

紫癜性肾炎（henoch-schönlein purpura nephritis，HSPN）是继发于过敏性紫癜的肾小球疾病，多发于儿童时期，其中90%的患儿年龄在10岁以下，临床表现主要以血尿和（或）蛋白尿为特征［1］。过敏性紫癜（henoch-schönlein purpura，HSP）的发病率为（3～27例）/10万［2-3］，且逐年呈升高的趋势，其中约30%～50%的患儿发展为HSPN［4］，大部分患儿预后良好，但仍有20%的患儿出现肾功能不全甚至发展为终末期肾衰竭，威胁患儿生命健康［5］。肾脏受累的严重程度影响着远期预后，故及时评估肾脏的病理变化情况，对采取规范的治疗及改善远期预后至关重要。目前，肾脏穿刺是评估肾脏病变的公认标准，但其是一项创伤性操作，有潜在风险，多数情况下不能被患者家属接受，肾脏穿刺技能要求严格，基层医院鲜有具备肾脏穿刺操作的条件，因此寻找安全、无创及便捷的方法评估HSPN的病情变化是国内外学者研究的热点及难点。

HSPN的发生、发展与免疫、环境、遗传及细胞因子、炎性介质等多种因素有关，其中补体系统活化是非常重要的因素。补体系统是人体固有免疫不可或缺的成分，除参与机体防御反应和维持内环境稳定外，也是介导组织损伤和细胞免疫的桥梁，与多种肾脏疾病的发生、发展相关［6-7］。研究发现IgAN患者血浆中C3a的水平高于健康人，且与IgAN的活动及严重程度相关［8］，在HSPN患者的肾脏及血清中同样检测到C3a、C5b-9、B因子等补体因子［9-10］，而C3a、C5a作为补体系统激活释放的小分子产物，是促炎的主要介质，需要与特应性受体C3aR及C5aR结合而发挥作用，但其在HSPN诊断价值中的研究较少。

本研究拟比较HSPN患儿急性期与恢复期血清中C3a及C5a的水平，并分析与24 h尿蛋白定量、肌酐及肾脏病理的相关性，以探讨C3a及C5a在HSPN诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 资料 本研究为单中心前瞻性临床对照研究，选择2018年5月至2018年12月河南中医药大学第一附属医院儿科肾脏病区住院的45例HSPN患儿、15例HSP患儿及同期体检的15例健康儿童作为研究对象，本研究经河南中医药大学伦理委员会批准。健康儿童15例，男孩9例，女孩7例，平均年龄（8.59±2.60）岁，平均体重（32.40±9.43）kg；HSP患儿15例，男孩8例，女孩7例，平均年龄（8.35±2.34）岁，平均体重（32.00±11.96）kg；HSPN患儿45例，男孩30例，女孩15例，平均年龄（9.00±2.35）岁，平均体重（34.47±14.01）kg，3组儿童在性别、年龄、体重上差异无统计学意义（P＞0.05）。HSPN患儿中有22例行肾脏穿刺术，其中病理类型Ⅱa级4例，Ⅱb级2例，Ⅲa级13例，Ⅲb级3例。

1.2 方法

1.2.1 纳排标准 纳入标准：①所有的HSPN患儿及HSP患儿均符合欧洲风湿病联盟（EULAR）制定的诊断标准；②年龄在2～18岁；③尿常规异常出现1周以上，病程不超过2个月；④针对尿检异常未使用过激素及雷公藤多苷片、CTX等免疫抑制剂；⑤患儿的监护人已同意并签署参与试验的知情同意书。排除标准：①临床诊断中发现除肾脏损伤以外的其他临床表现；②虽符合临床诊断标准，但其监护人未同意参与本次试验的患儿。

1.2.2 肾脏病理分级 肾脏的病理分级是根据国际肾脏疾病分类研究（ISKDC）病理学家推荐，分为6级，具体如下：Ⅰ级，微小改变；Ⅱ级，单纯系膜增生；Ⅲ级，系膜增生伴新月形/节段性病变（硬化、黏连、血栓形成）＜50%的肾小球；Ⅳ级，50%～75%的肾小球系膜增生伴新月形/节段性病变（与Ⅲ相同）；Ⅴ级，75%以上的肾小球系膜增生伴新月形/节段性病变（与Ⅲ相同）；Ⅵ级，膜增生样病变。

1.2.3 数据采集 HSPN患儿急性期为入院后进行治疗前即0周，恢复期为进行治疗12周后停药。采集所有入组儿童的年龄、性别、体重及HSPN患儿尿常规、24 h尿蛋白定量、肾脏病理类型等临床数据。尿常规及尿蛋白定量由医院儿科实验室进行检测，肾脏病理由儿科肾脏病理室进行检测。收集健康儿童、HSP患儿及HSPN患儿0周与12周的空腹静脉血，室温下静置1 h，3 000 r/min离心10 min，提取血清，标记后在-80℃冰箱里冷藏备用，使用酶联免疫检测试剂盒（武汉伊莱瑞特公司）检测血清中C3a及C5a的浓度，其中酶联免疫检测严格按照试剂盒说明书中的操作进行。

1.3 统计学分析 采用SPSS23.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。非正态分布资料以中位数（最小值～最大值）表示，组间比较采用秩和检验。使用ROC曲线评价诊断指标的敏感度和特异度。计数资料采用χ2检验比较。P＜0.05为差异有统计学意义。采用Pearson分析血清中C3a及C5a的水平与24 h尿蛋白定量的相关性，采用Spearman分析血清中C3a及C5a的水平与肾脏病理的相关性。

2 结果

2.1 3组儿童血清中的C3a和C5a水平比较 与健康儿童及HSP患儿相比，HSPN患儿血清中C3a水平差异有统计学意义（P＜0.01），健康儿童与HSP患儿血清中C3a水平差异有统计学意义（P＜0.01）；与健康儿童及HSP患儿相比，HSPN患儿血清中C5a水平差异有显著统计学意义（P＜0.01），健康儿童与HSP患儿血清中C5a水平差异有统计学意义（P＜0.05）。说明HSPN患儿体内存在着补体系统的激活，且血清中的C3a与C5a与肾脏损伤有关，具体见表1。

表1 3组儿童血清中C3a及C5a水平的比较（±s）Tab.1 Comparison of serum C3a and C5a levels among threegroups of children（±s）

表1 3组儿童血清中C3a及C5a水平的比较（±s）Tab.1 Comparison of serum C3a and C5a levels among threegroups of children（±s）

Note：Compared with healthy and HSP，1）P＜0.01；compared with healthy，2）P＜0.001；compared with healthy，3）P＜0.05.

Index C3a（pg/ml）C5a（ng/ml）Healthy 3 862.63±586.67 34 495.59±18 630.28 HSP 7 258.59±2 234.442）60 581.93±33 608.233）HSPN 9 590.87±2 742.581）89 244.82±33 254.491）

2.2 HSPN患儿急性期与恢复期血清中C3a和C5a水平的比较 本实验检测了HSPN患儿急性期及恢复期血清中C3a及C5a水平，在急性期（治疗前）血清中C3a及C5a的水平显著高于恢复期（治疗12周后），差异有统计学意义（P＜0.001），说明血清中的C3a及C5a的水平与疾病的活动性相关，具体见表2。

表2 HSPN患儿急性期与恢复期血清中C3a与C5a水平的比较（±s）Tab.2 Comparison of serum C3a and C5a levels in children with HSPN during acute phase and recovery phase（±s）

表2 HSPN患儿急性期与恢复期血清中C3a与C5a水平的比较（±s）Tab.2 Comparison of serum C3a and C5a levels in children with HSPN during acute phase and recovery phase（±s）

Index C3a（pg/ml）C5a（ng/ml）Acutephase 9 590.87±2 742.58 89 244.82±33 254.49 Recovery phase 3 427.34±981.12 27 010.25±18 276.64 T 15.65 10.13 P 0.000 1 0.000 1

2.3 HSPN患儿急性期血清中C3a和C5a与24 h尿蛋白定量的相关性 HSPN患儿急性期血清中C3a的水平与24 h尿蛋白定量呈正相关，相关系数为0.37，且P＜0.05，C5a的水平与24 h尿蛋白定量不相关，表明HSPN患儿血清中C3a的水平与尿蛋白排泄有关，具体见图1、2。

图1 血清中C3a与24 h尿蛋白定量散点图Fig.1 Quantitative scatter plot of serum C3a and 24 h urine protein

2.4 HSPN患儿血清中C3a和C5a与肌酐的相关性 HSPN患儿急性期血清中C3a和C5a的水平与血肌酐不相关，表明HSPN患儿体内存在补体系统的整体激活和局部激活，且局部激活占主要作用，具体见图3、4。

图2 血清C5a与24 h尿蛋白定量散点图Fig.2 Quantitative scatter plot of serum C5a and 24 h urine protein

图4 血清C5a与血肌酐散点图Fig.4 Scatter plot of serum C5a and serum creatinine

2.5 HSPN患儿血清中C3a和C5a与肾脏病理的相关性 45例HSPN患儿有22例行肾脏穿刺术，经Sperman检验肾脏穿刺患儿的血清中C3a和C5a的水平与肾脏病理等级呈正相关，相关系数分别为0.858及0.502，且P＜0.05，说明血清中C3a及C5a的水平可能与肾脏病理相关。

2.6 C3a和C5a检测HSPN的敏感性及特异性C3a诊断HSPN的敏感性为0.822，特异性为0.722，ROC曲线下面积为0.897，截点为7 621.94 ng/ml；C5a诊断HSPN的敏感性为0.756，特异性为0.611，ROC曲线下面积为0.835，截点为73 423 pg/ml，C3a联合C5a诊断HSPN的敏感性为0.822，特异性为0.867，ROC曲线下面积为0.909。见图5。

图5 C3a、C5a诊断HSPN的特异性及敏感性Fig.5 Specificity and sensitivity of C3a and C5a in diagnosis of HSPN

3 讨论

HSPN又称IgAVN，病理表现为IgA为主免疫复合物在系膜区沉积，伴有补体因子及大量中性粒细胞的浸润，临床表现为血尿和（或）蛋白尿，伴有肾外小血管炎性病变为主。HSPN的发病机制目前尚不明确，但补体系统激活参与了HSPN的发病及发展。补体系统作为先天免疫的一部分而发挥作用，补体激活后产生炎症因子、趋化因子，促使中性粒细胞趋化和单核细胞产生蛋白酶、氧自由基和花生四烯酸代谢产物，而单核细胞的吞噬功能使得肾小球基膜降解、细胞受损以及肾小球滤过率降低，从而导致肾脏损伤［11-12］。在肾脏疾病患者的血液、尿液及肾组织中能检测到各类补体成分［13-14］。

补体系统的激活有3条途径，即经典途径、旁路途径和凝集素途径［15-16］。经典途径由与抗原结合的IgM或IgG引发，抗原抗体复合物结合C1q，通过裂解C4和C2，形成C3转化酶（C4b2b）；凝集素途径是由细菌直接结合甘露聚糖凝集素（MBL）启动，病原微生物感染机体后，诱导机体产生MBL并与相关丝氨酸蛋白酶1和2（MASP1和MASP2）结合，进而裂解C4和C2，最终形成与经典途径相同的C3转化酶C4b2b，这种补体激活机制可在凋亡或坏死组织激活补体中起重要作用，并加重IgA介导的肾脏损伤［17］；替代激活途径既不需要抗原-抗体复合物，也不需要激活C1、C2和C4，补体C3自发水解后形成C3（H2O）Bb，进而结合B因子，在D因子的酶解作用下形成C3转化酶（C3bBb）。

C3是3条途径的共同汇聚点，补体系统被激活后，以C3转化酶为核心依次产生C3a、C5a及膜攻击复合物（MAC），从而导致靶细胞溶解。研究发现C3a能够激活内皮细胞，从而上调血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达［18］。C5a的作用比C3a更强烈，能够促进IL-1、IL-6、IL-17及TNF-α等炎症因子的释放，损伤内皮细胞，参与HSPN患儿急性期的炎症反应［19］。

YANG等［20］研究发现30例HSP患者急性期血清中C3a及C5a的水平高于健康儿童，恢复期出现下降，30例HSP患者中仅有6例出现肾脏损害，但未对HSPN与HSP非肾脏损害患者血清中C3a与C5a的水平进行比较。本研究首次将HSPN患儿与HSP非肾脏损伤的患儿血清中C3a及C5a的水平进行比较，以验证血清中C3a及C5a是否参与了肾脏的损伤，研究发现HSP患者存在补体系统的激活，且C3a及C5a的水平可能与肾脏的损伤及病情活动相关。

ABOU-RAGHEB等［21］发现46名IgAN/HSPN患者血清中C3a的水平升高，且C3a的水平与血肌酐的水平相关，但与24 h尿蛋白排泄无关。有研究发现MBL的沉积与尿蛋白的排泄增加、肌酐升高及严重的组织学病理损害相关［22］。本研究对HSPN患儿血清中C3a和C5a的水平与24 h尿蛋白、肌酐及肾脏病理均做了相关性分析，结果发现HSPN患者血清中C3a与尿蛋白排泄相关，但与肌酐无关，而C5a的水平与尿蛋白及肌酐均不相关，行肾脏穿刺22例HSPN患者血清中C3a和C5a的水平与肾脏病理的分级相关。我们推测补体系统在肾脏局部均存在着异常激活，且局部激活对病情进展的诱导作用更大。血清中的C3a和C5a与相应受体结合而发挥作用，但全身循环中C3a和C5a的半衰期较短，补体系统局部的激活，可能直接损害相应的靶器官，而不是系统性的改变，补体系统沉积于肾脏，局部的激活从而导致相应的病理改变。

本研究存在一定的局限性：首先我们纳入的标本量相对较少，尤其是肾脏穿刺的患者仅有22例，且肾脏病理以Ⅲa级为主，存在一定的选择偏倚，且有限数量的患者限制了我们的进一步分析，也可能导致目前结果的偏差，我们需要多中心及更大数量的标本量来进一步研究HSPN中的补体激活机制。其次我们未对行肾穿患儿的肾脏组织中C3a和C5a的沉积进行检测，仅分析了血清中C3a和C5a与肾脏病理的相关性，可能导致结果有一定的误差，需要扩大样本量完善肾脏组织中C3a和C5a沉积的检测，以进一步证实C3a和C5a在HSPN诊断中的应用价值。

目前我们的研究表明补体系统激活可能与HSPN的发病及疾病的严重程度相关，从而推测抑制补体激活可能有助于HSPN的治疗。补体抑制药的治疗试验对于确认补体激活是不是参与了病情的进展也很必要。目前补体抑制药物依库珠单抗已用于C3肾小球疾病，并取得了一定的成效［23］，但尚无使用依库珠单抗治疗HSPN的案例，后续我们可以试验性使用依库珠单抗治疗难治性HSPN，希望能够为HSPN患者带来一种新的治疗方案。如果补体激活参与HSPN的发病得到证实，补体激活片段可作为HSPN患者无创性、方便、灵活的监测指标，同时阻断其受体也可作为疾病的潜在治疗靶点，为HSPN患者的治疗提供新思路及依据。

综上所述，补体激活的炎性小片段C3a和C5a可能参与了HSPN的发病，且与疾病的严重程度相关，可作为一种监测病情的指标。