热炎宁合剂HPLC指纹图谱研究

苏永健 刘红娜 杜鑫 张小华 张仙娟

(1.清华德人西安幸福制药有限公司，陕西 西安 710043；2.陕西创新医药研究中试工程中心有限公司,陕西 西安 710043)

热炎宁合剂由清华德人西安幸福制药有限公司独家生产，是《中国药典》2015年版(一部)收录品种。热炎宁合剂由蒲公英、虎杖、北败酱、半枝莲4味药组成。功能为清热解毒，用于外感风热、内郁化火所致的风热感冒、发热、咽喉肿痛、口苦咽干、咳嗽痰黄、尿黄便结、化脓性扁桃体炎、急性咽炎、急性支气管炎、单纯性肺炎见上述证候者[1]。现代研究证明热炎宁合剂在治疗小儿急性上呼吸道感染及扁桃体发炎时疗效显著[2]。最新研究证明热炎宁合剂能改善新型冠状病毒肺炎患者临床症状，促进胸部CT好转，缩短患者发热时间，提高核酸转阴率[3]。

目前关于热炎宁合剂质量控制研究的文献报道较少，主要以虎杖、蒲公英、北败酱、半枝莲中化学成分含量检测为主。据文献报道：虎杖中主要含蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类、香豆素类以及一些脂肪酸类化合物[4-5]，蒲公英中主要含黄酮类、多糖类、色素类、有机酸类物质[6-9]，北败酱中主要含黄酮类化合物及酯类和烷烃类成分、三萜类、甾体类、内酯类和有机酸等[10-13]，半枝莲中主要含黄酮类、二萜类、挥发油类及多糖等化学成分[14-15]。指纹图谱技术是近年逐渐发展起来的一项质量控制技术，它具有信息量大，特征性强，能整体控制多种组分[16-17]。本实验参照2015年版《中国药典》(一部)及相关文献[18-25]，建立了以蒲公英、虎杖、北败酱、半枝莲中化学成分为主要指标的HPLC指纹图谱，通过共有峰归属和指认来控制热炎宁合剂的质量。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent1260 infinityII型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AG285型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；L-500型离心机(长沙湘仪离心机有限公司)。

1.2试剂与试药 虎杖苷(批号111575-201603，纯度87.3%)，大黄素(批号110756-201512，纯度98.7%)，木犀草素(批号111520-201605，纯度99.6%)，咖啡酸(批号110885-201703，纯度99.7%)，绿原酸(批号110753-201817，纯度96.8%)均购于中国食品药品检定研究院；热炎宁合剂(清华德人西安幸福制药有限公司)；色谱乙腈、色谱甲醇(美国Fisher公司)；磷酸(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)；甲醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(150mm×4.6mm，4μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸(B)；梯度洗脱程序(0-35min，10%-35%A，90%-65%B；35-40min，35%-85%A，65%-15%B；40-45min，85%-100%A，15%-0%B；45-50min，100%-10%A，0%-90%B；50-60min，10%-10%A，90%-90%B)；体积流量0.8 mL/min；检测波长：305nm；柱温30℃；进样量10μL。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液制备 取大黄素对照品、虎杖苷对照品、木犀草素对照品、绿原酸对照品、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1mL含大黄素80μg、虎杖苷350μg、木犀草素60μg、绿原酸90μg、咖啡酸80μg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液 量取热炎宁合剂10mL于离心管中，离心(4000转/min)5分钟，精密量取2mL上清液，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇90 mL，超声30min，至室温后再加甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。10批热炎宁合剂为清华德人西安幸福制药有限公司生产，样品批号见表1

表1 样品信息表

2.2.3阴性样品溶液 参照2015年版《中国药典》(一部)热炎宁合剂提取制备方法，分别制备缺4味药材的阴性样品，按2.2.2项下方法制备，即得。

2.3方法学考察

2.3.1精密度考察 用批号为190318的样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下连续进样6针，以大黄素为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD<3%，相对保留时间RSD<2%，表明仪器精密度良好。

2.3.2稳定性考察 用批号为190318的样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下于0、2、4、8、12、24h进样，以大黄素为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD<3%，相对保留时间RSD<1%，表明供试品溶液24h内稳定性良好。

2.3.3重复性试验 用批号为190318的样品，按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，在2.1项色谱条件下进样，以大黄素为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD<3%，相对保留时间RSD<2%，表明该方法重现性良好。

2.4指纹图谱建立

2.4.1共有峰标定 选取大黄素为参照峰，色谱图中各色谱峰保留时间与参照峰(S)保留时间的比值为相对保留时间，通过相对保留时间值标定共有峰，其中13个峰为10批样品共有，标定为共有峰，共有峰见图1。

图1 10批热炎宁合剂样品HPLC图

2.4.2相似度评价 共有峰通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)分析，中位数法建立对照指纹图谱，结果见图2。10批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均在0.980以上，结果见表2。

图2 对照指纹图谱

表2 相似度分析结果

2.4.3专属性考察 分别吸取4种阴性样品溶液，在2.1项色谱条件下进样，色谱图见图3。通过与阴性样比较可以得出1号、2号、3号、5号峰归属北败酱及蒲公英(北败酱及蒲公英化学成分相似)，4号、6号、7号、10号、11、号12号、13号归属虎杖，8号峰归属半枝莲，9号峰属归北败酱。

S1:热炎宁合剂 S2：虎杖阴性样 S3：半枝莲阴性样 S4：蒲公英阴性样 S5：北败酱阴性样

2.4.4共有峰指认 吸取2.2.1项对照品溶液及2.2.2供试品溶液，在2.1项色谱条件下进样，色谱图见图4。通过对照品对共有峰进行指认：2号峰为绿原酸, 3号峰咖啡酸, 4号峰为虎杖苷，9号峰为木犀草素，13号峰为大黄素，共指认5个共有峰。

A对照品HPLC图

3 讨论

本试验采用不同浓度乙醇及甲醇分别对样品进行超声处理，并对超声时间等条件进行考察，结果发现用甲醇超声处理30 min后，色谱基线更平稳，峰数量较多，因此本实验采用甲醇超声处理30 min进行样品制备。本实验用甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈0.4%磷酸分别做梯度洗脱考察，结果发现用乙腈-0.1%磷酸进行梯度洗脱，色谱基线平稳，各峰分离度较好，因此采用乙腈-0.1%磷酸作为梯度洗脱流动相。本研究还对流速，检测波长，柱温等进行了考察，最后选定流速为0.8 mL/min；检测波长：305nm；柱温30℃。

《中国药典》2015版一部中热炎宁合剂质量标准中，只对虎杖进行了薄层鉴别，含量测定项也只针对虎杖中的大黄素及虎杖苷进行测定，对处方中蒲公英、北败酱、半枝莲没有制定控制项目，不能全面控制热炎宁合剂质量。本试验通过对样品处理方法，色谱条件的考察，通过10批样品检测建立对照指纹图谱，确认13个共有峰，通过阴性样品比对，将13个共有峰分别归属于4种药材，本方法较全面反映了热炎宁合剂中各种成分的分布和比例关系，对更好控制热炎宁合剂质量发挥重要作用。