卵泡期长效长方案改善反复种植失败患者IVF/ICSI的临床结局*

李文澍，包洪初，张 伟，赵慧珊，刘雪梅1,

(1.青岛大学，青岛 266071;2.青岛大学附属烟台毓璜顶医院生殖医学中心，烟台 266000)

胚胎移植是辅助生殖技术中的重要环节，决定着辅助生殖的最终临床结局。在自然状态下，胚胎植入子宫内膜的几率不足30%，即使行体外受精-胚胎移植术(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)，胚胎种植率仍仅有30%～40%，过低的胚胎种植率导致反复种植失败(recurrent implantation failure,RIF)。RIF的定义尚不明确，现共识认为，40岁以下行IVF-ET的患者在3个移植周期至少移植4枚优质胚胎后均未成功妊娠称为RIF[1]，其已成为制约辅助生殖技术发展的难题。

成功的胚胎植入需胚胎-子宫内膜交互界面处于融洽的状态，因此胚胎质量低下、子宫结构功能异常、子宫蠕动过频、子宫内膜炎症、母体血栓形成倾向、母体免疫状态紊乱等都是导致RIF的病因。此外，年龄、肥胖、不良生活习惯及环境暴露等也是RIF常见的诱发因素[2]。从更微观的角度而言，子宫内膜容受性往往决定着胚胎植入的进程与结局，若种植窗口出现移位甚至关闭，导致胚胎侵入子宫内膜的过程缺乏相应的细胞因子提供动力学支持，最终导致着床失败[3]。因此，对于RIF患者，改善其子宫内膜容受性成为诸多治疗方案的核心目标。现在无论是子宫内膜容受性芯片检测技术(ERA)亦或粒细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)的宫内灌注都在尝试通过改善子宫内膜容受性以达到提高临床妊娠率的目的[4-5]。

众所周知，卵巢控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)是IVF的重要步骤，促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRH-a)也已在COH中得到广泛应用。先前曾有研究表明,相较于拮抗剂方案，GnRH激动剂方案可显著提高患者胚胎移植后的临床妊娠率和胚胎种植率，并推测其原因是GnRH-a提高了卵母细胞质量和子宫内膜容受性[6-7]。在此基础上，研究者提出了卵泡期长效长方案，患者只需进行一次长效GnRH-a的注射，因其治疗周期短，治疗过程简单方便，成为一种安全有效的高性价比选择。目前卵泡期长效长方案已在不同病因不孕人群中得到广泛应用，已有相关研究表明该方案可显著提高不孕患者的胚胎种植率和临床妊娠率。一项最新研究则进一步从微观机制上证实了该方案可通过影响子宫内膜容受性相关基因与蛋白的表达改善不孕患者子宫内膜容受性[8]。但目前尚缺乏卵泡期长效长方案对RIF患者IVF/ICSI临床结局作用的临床证据。本研究旨在评估卵泡期长效长方案对RIF患者IVF/ICSI临床结局的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾分析青岛大学附属烟台毓璜顶医院生殖医学中心于2015年6月至2020年6月间再行IVF/ICSI助孕的RIF患者的临床资料。患者年龄是影响妊娠结局的重要因素，患者年龄>40岁后，卵母细胞的数量和质量急剧下降，间接导致获卵数、临床妊娠率和活产率逐渐下降[9]。纳入标准：(1)患者年龄20～40岁；(2)既往经历3个移植周期至少移植4枚优质胚胎后均未成功妊娠。排除标准:卵巢功能减退、生殖系统解剖结构异常(如子宫畸形、宫腔粘连等)、染色体异常(夫妻双方或一方)、患有自身免疫系统疾病(如抗磷脂综合征)以及严重的全身性疾病(如甲状腺或肾上腺功能障碍、肾或肝功能严重等)的患者。本研究经烟台毓璜顶医院伦理委员会批准(No：2019-373)。研究共纳入730例患者，根据COH方案分为3组：拮抗剂方案组(组1)、长方案组(组2)和卵泡期长效长方案组(组3)。

1.2 IVF/ICSI过程

1.2.1 拮抗剂方案 在月经周期第3天阴道超声及血清FSH、LH、E2和P检查确定患者处于基础状态后，每日给予Gn 125～225IU。优势卵泡直径达到12mm，E2>150pg/mL或LH>10IU/L时，开始注射GnRH拮抗剂(加尼瑞克，欧加农，荷兰)0.25mg/d。

1.2.2 长方案 在前一周期的黄体中期开始皮下注射短效GnRH-a制剂(醋酸曲普瑞林，辉凌制药，荷兰)0.05mg/d。14～18d后阴道超声及血清FSH、LH、E2和P评估垂体降调效果，达到降调标准(FSH<5mIU/mL，LH<3mIU/mL，E2<30pg/mL，超声示子宫内膜<5mm，双侧卵巢直径不超过10mm)后每天给予Gn 125～250IU促进卵泡发育。

1.2.3 卵泡期长效长方案 在月经周期第2～3d给予长效GnRH-a制剂(醋酸曲普瑞林，辉凌制药，荷兰)3.75mg使垂体降调。28～40天后阴道超声和血清促卵泡刺激素(FSH)、促黄体形成素(LH)、雌激素(E2)和孕激素(P)评价垂体降调效果(降调标准同长方案)，达到启动标准时开始每日给予促性腺激素(Gn)125～250IU促进卵泡发育。

长方案和拮抗剂方案中的短效醋酸曲普瑞林和加尼瑞克需连续注射至夜针日。当有1个或2个直径大于18mm的优势卵泡时扳机，注射绒毛膜促性腺激素(HCG 6000～8000IU)后34～36h经阴道取卵。取卵日根据精液情况行IVF或ICSI受精，取卵后开始给予阴道用药黄体酮(安琪坦TM,Besins-Iscovesco,法国)行黄体支持。

D3卵裂期胚胎分级标准：1级:卵裂球大小均匀，形态规则，胞质均匀清晰，碎片<10%；2级:卵裂球大小均匀或略欠均匀，形态欠规则，碎片10%～20%；3级：卵裂球大小不均，形态欠规则，碎片20%～50%；4级:卵裂球大小严重不均，碎片>50%。D3优质胚胎标准为细胞数7～12个，碎片≤20%(1级、2级胚胎)，D3可移植胚胎为细胞数≥4个，碎片≤50%，胚胎内无异常结构(1级、2级、3级胚胎)。取卵后第3天进行胚胎移植，移植14天后进行妊娠试验，临床妊娠的定义为移植4周后阴道超声检查存在宫内活胎，妊娠维持至分娩活胎儿后为活产。

1.3 观察指标 3组不孕患者的基础状态、临床特征；不同方案启动日E2和LH水平,HCG日血清E2、LH和P水平,Gn天数、Gn总量、HCG日子宫内膜厚度、获卵数、MⅡ卵数、正常受精率(2PN受精数/获卵数×100%)、优胚率(优质胚胎数/胚胎形成数×100%)、临床妊娠率(临床妊娠周期数/移植周期数×100%)、胚胎种植率(孕囊形成数/移植胚胎数×100%)、活产率(分娩活胎数/移植周期数×100%)和OHSS发生率(OHSS周期数/取卵周期数×100%)。

2 结 果

2.1 3组患者的临床特征 730例患者中，拮抗剂方案351例(组1)，长方案258例(组2)，卵泡期长效长方案121例(组3)。3组患者的年龄、不孕年限、BMI、AMH水平、既往周期数、既往妊娠史和不孕症类型比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

2.2 3组患者COH过程中的参数比较 卵泡期长效长方案的Gn总量和Gn时间明显增加，HCG日子宫内膜厚度显著高于其他两组(P<0.001)，但启动日和HCG日的LH与E2水平显著低于其他两组(P<0.001)。3组患者COH过程中孕酮水平、获卵数、MⅡ卵数、受精方式、受精率、优胚率、囊胚形成率、移植胚胎数与移植优胚数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 3组患者的临床特征

表2 三组患者COH过程中的参数比较

2.3 患者临床结局的比较 相对于拮抗剂和长方案，卵泡期长效长方案能显著提高反复种植失败患者IVF/ICSI的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率(30.42%、30.00%、40.60%，P=0.036；43.39%、39.56%、55.55%，P=0.042；33.79%、36.81%、51.11%，P=0.016)，但3组的OHSS发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 3组患者的临床结局的比较

3 讨 论

本研究对卵泡期长效长方案在RIF患者IVF/ICSI中的临床作用进行了评价研究。研究发现，卵泡期长效长方案可对降低启动日和HCG日的LH与E2水平，增加Gn时间、Gn总量及HCG日子宫内膜厚度，最终提高RIF患者IVF/ICSI的临床妊娠率、胚胎种植率和活产率，在此基础上也并未增加OHSS的发生率。因此认为卵泡期长效长方案相对于长方案和拮抗剂方案可改善RIF患者IVF/ICSI的临床结局。

卵泡期长效长方案因其操作简易及较好的经济适用性，已在子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)、卵巢正常储备、卵巢低反应和多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)等不孕患者中得到广泛应用。已有多项研究观察了卵泡期长效长方案对不同病因不孕症患者IVF临床结局的影响，发现卵泡期长效长方案相较于其他方案对子宫内膜厚度、胚胎种植率、临床妊娠率和持续妊娠率均可起到一定程度的改善作用[9-13]。卵泡期长效长方案因其作用时间与方式类似于EMs患者IVF前GnRH-a预处理[14]，故首先被应用于EMs相关不孕患者。Kong等[10]研究指出,对于EMs患者，卵泡期长效方案相比于短效长方案虽然在妊娠结局上无显著差异，但长效方案可减少患者的注射和就诊次数，单次应用长效GnRH-a方案可成为治疗EMs患者的一种经济有效安全的方案。Geng等[11]进一步指出,在卵巢正常储备人群中应用卵泡期长效长方案比拮抗剂方案有更高的胚胎种植率和临床妊娠率，并推测卵泡期长效长方案对子宫内膜容受性产生了积极的影响。对于卵巢低反应患者，Li等[12]研究指出，对于波塞冬I型和III型患者，卵泡期长效长方案比黄体期长方案、拮抗剂方案有着更高的临床妊娠率和活产率。虽然卵泡期长效长方案可能增加患者并发OHSS的风险，但亦有相关研究支持该方案可提高多囊卵巢患者IVF后的HCG日子宫内膜厚度、优胚率、胚胎种植率及临床妊娠率[13]。本中心先前的研究亦取得了与上述研究相似的结果，发现卵泡期长效长方案可改善EMs患者及卵巢低反应患者行IVF/ICSI的临床结局。通过本研究我们又论证了卵泡期长效长方案对RIF患者IVF/ICSI临床结局的改善作用。

目前，RIF的治疗重点是改善患者的子宫内膜容受性，故对卵泡期长效长方案作用机制的探讨也应集中于长效GnRH-a对子宫内膜容受性的影响。众所周知，子宫内膜厚度是影响子宫内膜容受性的重要因素，HCG日子宫内膜厚度与IVF临床妊娠率之间存在正线性关系[15]。已有研究证实,长效长方案可增加HCG日子宫内膜厚度[8，11]。本研究发现，卵泡期长效长方案组的HCG日子宫内膜厚度显著增加，所以该方案可能通过增加子宫内膜厚度改善子宫内膜容受性。最新一项研究证实，GnRH-a可通过增加子宫内膜整合素avβ3及HOXA10基因的表达，减轻局部炎症反应，从而调节种植窗口的开启时间与持续时长，改善子宫内膜容受性[8]。此外，本研究表明，卵泡期长效长方案可显著降低RIF患者体内LH水平，低LH水平可间接降低雄激素和雌激素水平，从而改善子宫内膜容受性[16-17]。此外，有研究提出“子宫内膜恢复”假说，认为自然闭经可增加子宫内膜容受性，改善临床妊娠[18]。卵泡期长效长方案可通过长效GnRHa抑制垂体达到类似闭经的效果，从而改善子宫内膜容受性。综上所述，卵泡期长效长方案通过以下四点改善子宫内膜容受性：增加HCG日子宫内膜厚度，调节子宫内膜容受性相关基因表达，降低HCG日LH水平与雌激素水平，假闭经状态促进子宫内膜的修复与更新。

综上所述，卵泡期长效长方案可通过改善子宫内膜容受性的方式改善RIF患者的IVF/ICSI临床结局。本研究结果有待于今后大规模随机对照试验及相关基础实验的进一步证实和探讨。